Xét Nghiệm Bằng Phương Pháp Pcr / TOP 11 # Xem Nhiều Nhất & Mới Nhất 5/2023 # Top View

PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng phân) là một kỹ thuật then chốt trong di truyền học phân tử, được áp dụng để test kiểm tra nhiễm HIV giai đoạn sớm với độ nhạy cao.

Kĩ thuật này cho phép phân tích bất kỳ một đoạn ngắn nào của chuỗi ADN (hay của chuỗi ARN) mà không phải nhân dòng vô tính đoạn ADN đó.

PCR được sử dụng để tái tạo (khuếch đại) những đoạn ADN chọn lọc. Trước đây, việc khuếch đại này được thực hiện nhờ những vi khuẩn và phải mất hàng tuần. Nhưng giờ đây với kỹ thuật PCR được thực hiện trong các ống nghiệm thì chỉ mất một vài giờ. PCR hiệu quả cao đến nỗi có thể tạo ra vô số bản sao của ADN. Ngoài ra, PCR sử dụng chính những phân tử mà thiên nhiên sử dụng để sao chép ADN:

– Hai “phân tử mồi” để đánh dấu vị trí bắt đầu và kết thúc của chuỗi ADN cần sao chép. – Một enzym có tên là polymerase (enzyme đồng phân hóa) chạy dọc theo đoạn ADN đó, đọc mã của ADN và lắp ráp nên một bản sao của ADN. – Rất nhiều khối bazơ mà polymerase sử dụng để xây nên bản sao của ADN.

Do thử nghiệm PCR quá nhạy cảm, nên khi áp dụng trong chẩn đoán, một vấn đề rất quan trọng cần phải lưu tâm, đó là hiện tượng dương tính giả, chủ yếu là do mẫu thử bị nhiễm bởi các sản phẩm PCR trước đó. Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mảnh sản phẩm PCR thì các mảnh này sẽ được khuếch đại và mẫu cho kết quả dương nhưng là dương giả. Đợi 12 tuần là cần thiết. Việc gì mà vội hả bạn ?

Hiện nay xét nghiệm DNA_ PCR(Chuỗi phản ứng polymerase) là một trong những xét nghiệm có độ chính xác cao nhất tuy nhiên thời gian chính xác để thực hiện xét nghiệm này từ ngày có hanh vi nguy cơ vẫn còn gây nhiều tranh cãi (theo các tài liệu nước ngoài là 28 ngày,một số tài liệu của VN là 10 ngày hoặc theo một số bác sĩ của viện Pasteur là từ 3-7 ngày). Đây là một xét nghiệm khá tốn kém và quy trình khá phức tạp( dựa trên kĩ thuật nhiệt) nên thường chỉ dùng cho trẻ em(dưới 18 tháng tuổi) để phát hiện bản sao bộ ADN của HIV.Như Hiện tại theo mình biết viện Pasteur TPHCM dùng phương pháp này để xét nghiệm cho trẻ em dưới 18 tháng tuổi hoặc dùng đo nồng độ vi rút cho người có HIV.Viện Pasteur TPHCM nếu xét nghiệm PCR âm tính (dưới ngưỡng phát hiện) thì Bác Sĩ vẫn khuyên sau 12 tuần xét nghiệm lại

Mọi thắc mắc về vấn đề HIV, vui lòng gọi đến tổng đài 19006237 để được tư vấn HIV, tư vấn xét nghiệm HIV trực tiếp từ các chuyên gia.

Xét nghiệm PCR (Polemerase Chain Reaction, phản ứng chuỗi polymerase) được cho là xét nghiệm có giá trị rất cao và được thực hiện từ trong giai đoạn sớm. Đây là một phương pháp xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao.

1. Xét nghiệm PCR là gì?

Xét nghiệm PCR hay còn gọi là xét nghiệm sinh học phân tử là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985.

Xét nghiệm PCR đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học do phản ứng rất nhạy và cho kết quả đặc hiệu. Xét nghiệm PCR thường có kết quả độ chính xác rất cao. Tuy nhiên kết quả cũng còn tùy thuộc trình độ của kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc và việc quản lý chất lượng. Cùng một xét nghiệm nhưng có nơi cho kết quả nhạy và chính xác, nơi khác thì không có được độ nhạy bằng.

Hiện nay để thực hiện xét nghiệm PCR thường đắt tiền hơn so với các xét nghiệm thông thường khác do hầu hết hóa chất để làm phản ứng đều phải nhập ngoại và phải mua với giá cao. Chưa kể các thiết bị để làm xét nghiệm PCR cũng lên đến vài chục ngàn USD/máy. Để xét nghiệm một bệnh phẩm, thường bạn phải chi trả 8-10 USD/lần.

2. Xét nghiệm PCR chẩn đoán bệnh gì?

Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).

Phát hiện các vi khuẩn lậu (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).

Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (vd: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).

Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA1 – BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin…)

Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…

Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus – MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase…)

Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli.

Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…

3. Ưu – nhược điểm của xét nghiệm PCR

3.1. Ưu điểm

Phương pháp xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm thông thường khác như:

Cho kết quả xét nghiệm nhanh, thường không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét nghiệm.

Phát hiện được các tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm lâm sàng không có khả năng phát hiện với các xét nghiệm vi sinh hay miễn dịch truyền thống như các tác nhân virus (HCV, HBV, HPV…)

Xét nghiệm sinh học phân tử cho phép xác định được những tác nhân vi sinh không thể triển khai nuôi cấy được tại phòng thí nghiệm lâm sàng vì khả năng gây dịch cao (H5N1) hay khó nuôi cấy (C. trachomatis, L.pneumophila), hay có mặt rất ít trong bệnh phẩm ( tuberculosis trong lao ngoài phổi, tác nhân viêm màng não mủ cụt đầu…), hay là các tác nhân có thể nuôi cấy được nhưng thời gian có kết quả chung cuộc quá lâu (M. tuberculosis).

Xét nghiệm PCR còn có thể cho ra kết quả định lượng chính xác số bản copies virus/ 1 ml máu. Từ đó hỗ trợ rất đắc lực cho bác sĩ đánh giá được hiệu quả điều trị, cũng như tiên lượng giai đoạn bệnh.

Phát hiện các đột biến gen gây ung thư, gây các bệnh di truyền khác…nhằm có biện pháp phòng ngừa bệnh.

Xác định mối quan hệ huyết thống giữa những cá thể khác nhau.

3.2. Nhược điểm

Xét nghiệm PCR rất khó thực hiện được một cách chuẩn mực tại các phòng thí nghiệm lâm sàng.

Giá thành của xét nghiệm PCR khá cao.

Xét nghiệm PCR đòi hỏi trình độ của kỹ thuật viên, bác sĩ phải là người có trình độ chuyên môn cao.

Đòi hỏi trang thiết bị, máy móc kỹ thuật hiện đại.

Để được tư vấn trực tiếp, Quý Khách vui lòng bấm số HOTLINE hoặc đăng ký trực tuyến TẠI ĐÂY.

Virus HIV sống được bao lâu ?

Virus HIV có thể tồn tại trong không khí với nhiệt độ trung bình từ 32 đến 36 độ không quá 5 phút. Ỏ trong những giọt máu khô thì virus có thể sống từ 2-7 ngày và trong xác chết thì virus có thể sống trong 72 giờ.

Cùng với đó đối với những giọt máu của người bị nhiễm HIV ở trên đường mà bị ánh nắng chiếu vào thì virus HIV có thể sống được trong khoảng 30 phút. Đối với những giọt máu ở trong những chỗ ẩm thấp thì virus HIV có thể sống trong 48h hoặc có thể là 1 tuần.

Phương pháp xét nghiệm PCR HIV là phương pháp xét nghiệm có giá trị cao nhất trong các phương pháp xét nghiệm HIV. Phương pháp này có thể tạo ra một lượng lớn các bản sao DNA mà không cần phải nhân dòng vô tính của đoạn DNA đó hoặc các gen này được khuếch đại với một mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt độ.. Đây cũng là phương pháp xét nghiệm HIV có độ chính xác và độ hiệu quả cao nhất.

PCR được sử dụng trong việc khuếch đại những đoạn DNA đã được chọn lọc. Khác với những phương pháp xét nghiệm HIV từ xưa thì việc khuếch đại này sẽ được thực hiện nhờ một số vi khuẩn và các phương pháp này thường mất một khoảng thời gian dài mới có kết quả.

Hiện nay với việc thực hiện Xét nghiệm HIV bằng phương pháp PCR thì chỉ mất vài giờ thực hiện trên ống nghiệm là đã có kết quả.

Các bước tiến hành xét nghiệm PCR HIV hiện nay

Bước 1: Các bác sĩ sẽ tách rời hai chuỗi phân tử DNA ở nhiệt độ khoảng 940 đến 950.

Bước 2: Tiến hành bắt cặp các cặp mồi đặc hiệu của quy trình DNA được xác định bắt cặp với các sợi DNA đích. Việc bắt cặp này thường được thực hiện ở nhiệt độ khoảng 400 đến 700.

Bước 3: Ở bước này thì chỉ cần tổng hợp và kéo dài các sợi DNA ở nhiệt độ khoảng 720 do các Taq polymerase sẽ thực hiện tổng hợp các sợi DNA theo một trình tự bổ sung cho các sợi khuôn.

Ở trẻ sơ sinh trong quá trình chẩn đoán HIV ngoài việc thực hiện xét nghiệm theo phương pháp PCR thì còn có thể sử PCR để phát hiện ra các DNA provirus trong một số tế bào trong tình trạng bị nhiễm bệnh.

Với phương pháp xét nghiệm PCR HIV được thực hiện ở trên 3 vùng gen đó là: ENV, GAG và cuối cùng là POL. Việc thực hiện trên 3 vùng gen có thể cho kết quả là dương tính ít nhất ở 2 vùng trên 3 vùng gen này với cách thực hiện lấy mẫu ở một số thời điểm khác nhau.

Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp xét nghiệm PCR HIV

Phương pháp xét nghiệm PCR HIV có thể phát hiện ra các tác nhân vi sinh vật gây ra bệnh trực tiếp từ bệnh phẩm mà có thể phân loại các kiểu di truyền của các vi sinh vật này mà không cần phải qua môi trường nuôi cấy.

Phương pháp xét nghiệm PCR HIV thường cho kết quả giám định nhanh hơn sơ với việc thực hiện xét nghiệm HIV theo phương pháp cũ.

Phương pháp xét nghiệm HIV bằng PCR có độ nhạy cực kỳ cao trong việc chẩn đoán bệnh.

Nhược điểm của phương pháp xét nghiệm này

Để có thể thực hiện được phương pháp xét nghiệm PCR HIV này thì phải có một phòng xét nghiệm đủ tiêu chuẩn và được trang bị những thiết bị hiện đại nhất hiện nay. Cùng với việc cần phải có các trang thiết bị hiện đại thì cũng cần các bác sĩ thực hiện phương pháp này có trình độ chuyên môn cực kỳ cao.

Chi phí thực hiện xét nghiệm PCR HIV thường đắt hơn so với việc thực hiện xét nghiệm bằng phương pháp cũ. Nguyên nhân chủ yếu là do các hóa chất để thực hiện xét nghiệm PCR HIV thường phải nhập từ nước ngoài với giá cực kỳ cao. Cùng với đó là giá thành của một máy xét nghiệm PCR cũng cực kỳ đắt khoảng mấy chục ngàn USD/ máy. Chi phí thực hiện cũng đắt theo.

Những địa điểm có thể thực hiện xét nghiệm PCR HIV ở Việt Nam

Bệnh viện 198 tại địa chỉ: số 9 Trần Bình , Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội.

Bệnh viện bệnh nhiệt đới trung ương: số 78 Giải Phóng, Phương Mai, Đống Đa, Hà Nội.

Viện Huyết học và truyền máu trung ương: số 14 Trần Thái Tông, Yên Hòa, Cầu Giấy, Hà Nội.

Bệnh viện đa khoa Xanh – Pon: số 12 Chu Văn An, Điện Biên, Ba Đình, Hà Nội.

Bệnh viện Bạch mai: số 78 Giải Phóng, Phương Mai, Đống Đa, Hà Nội.

PCR (hay là phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase) là một kĩ thuật hiện đại, được ứng dụng rộng rãi trong Y khoa, như trong chuẩn đoán bệnh di truyền, bệnh do vi khuẩn, virus, ADN “dấu vân tay”, xác định huyết thống…

Nguyên lý hoạt động của PCR là tạo ra một lượng lớn các bản sao ADN từ một đoạn ADN chọn lọc, ở môi trường in vitro tương tự như trong quá trình phân bào, trong một thời gian ngắn. Lượng lớn ADN tạo thành được so sánh, đối chiếu với các mẫu chuẩn tại các ngân hàng dữ liệu ADN, các thông số, các đặc điểm chuẩn đã có sẵn để đưa ra kết quả.

Vậy, trong trường hợp vật chất di truyền không phải là ADN thì sao? Với những virus có vật chất di truyền là ARN, liệu có sử dụng được PRC không?

Để hiểu rõ vấn đề này chúng ta cần phân biệt được 2 kiểu phản ứng PCR: 

Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực

(

Real-time PCR

)

, còn gọi là qPCR.

Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (

Reverse transcription PCR

), gọi tắt là RT-PCR

1.

Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR)

qPCR là quá trình khuếch đại (sao chép) một đoạn ADN xác định lên hàng trăm nghìn lần, đủ để phân tích. Trước đó, các mẫu xét nghiệm được xử lý bằng hóa chất để  tách chiết ADN từ mẫu đó.

qPCR, ngoài là “PCR định lượng”, còn có nhiều các ứng dụng khác, tiêu biểu như:

Phát hiện gene mục tiêu (Định tính). Kết quả có thể là Âm/Dương 

Xác định kiểu gene (genotype, týp) của gene mục tiêu. Kết quả trả ra là genotype A, B, C, v.v…, 

Một số phản ứng khuếch đại ADN có bản chất là PCR, chúng đẳng nhiệt, nghĩa là chúng chạy ở một nhiệt độ không đổi. Và tiêu biểu nhất là khuếch đại phụ thuộc vào enzyme Helicase – một loại enzyme tháo xoắn – tương tự như PCR truyền thống, nhưng sử dụng nhiệt độ không đổi thay vì qua các bước tách chuỗi đôi ADN và phối hợp/mở rộng chuỗi bởi biến đổi nhiệt.

Hai phương pháp phổ biến để phát hiện các sản phẩm trong qPCR là sử dụng:

Thuốc nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu xen kẽ với bất kỳ ADN sợi kép.

Đầu dò đặc hiệu gồm oligonucleotide được dán nhãn bằng máy phóng 

huỳnh quang

.

2. Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR)

RT-PCR hiểu đơn giản là: đầu tiên cần sử dụng quá trình phiên mã ngược (tức chuyển ARN thành ADN lấy từ mẫu virus hay vi khuẩn có vật chất di truyền là ARN) để thu được ADN, sau đó dùng qPCR để khuếch đại ADN đó, đủ để phân tích. Quy trình RT-PCR thường cần khoảng 3h hoặc hơn.

Hình 1. RT-PCR và qPCR

RT-PCR có thể được tiến hành theo phương thức một bước và hai bước.

* RT-qPCR một bước, giai đoạn tổng hợp ADN (phiên mã ngược) và qPCR được tiến hành trong cùng một ống phản ứng bằng cùng một enzym. Phương thức này chỉ có thể sử dụng mồi đặc hiệu.

* RT-qPCR hai bước, giai đoạn tổng hợp ADN và qPCR được tiến hành trong hai ống phản ứng riêng biệt với enzym, đệm, thành phần và điều kiện phản ứng được tối ưu cho mỗi giai đoạn.

Hình 2. Sao chép ngược (RT-PCR) và tổng hợp ADN (qPCR)

Khuôn của RT-PCR là ARN, ARN này có thể nằm trong hỗn hợp ARN tổng số hoặc chỉ riêng mARN. Tách chiết ARN tổng số cần ít bước thực hiện hơn, giúp cho hiệu suất tách chiết cao hơn đồng thời thuận lợi hơn khi định mức lượng tế bào đầu vào. Ngoài ra, do không có bước làm giàu riêng mARN, sử dụng ARN tổng số không gây khác biệt trong hiệu suất tách chiết các loại mARN khác nhau. Những ưu thế trên đã giúp cho ARN tổng số được ưu tiên chọn làm vật liệu khởi đầu phù hợp cho RT-PCR hơn là mARN tinh sạch chỉ giúp phản ứng có độ nhạy cao hơn một chút.

Hình 3. Một số loại mồi dùng trong RT-PCR.

Mồi (Primer) phổ biến hay dùng trong RT-PCR là oligo dT và mồi ngẫu nhiên, nó sẽ liên kết bổ sung với khuôn ARN và làm điểm bắt đầu cho phản ứng tổng hợp ADN.

Enzym phiên mã ngược tiến hành phản ứng tổng hợp ADNc từ khuôn ARN. Một số enzym có hoạt tính RNAse cho phép phân hủy khuôn ARN sau khi đã tổng hợp ADN. Nếu enzym không có hoạt tính này, có thể cần bổ sung RNAse nhằm tăng hiệu quả của qPCR. Loại enzym phiên mã ngược thường dùng là enzym phiên mã ngược của virus ung thư bạch cầu chuột moloney (M-MLV) và virus cúm gia cầm (AMV). Tiêu chuẩn của một enzym phiên mã ngược lý tưởng cho phản ứng RT-PCR là có độ bền nhiệt tốt, cho phép tổng hợp hiệu quả ADN ở nhiệt độ cao trên những khuôn ARN có nhiều vùng cấu trúc bậc hai.

Cặp mồi lý tưởng cho phản ứng qPCR trong RT-PCR thường được thiết kế nằm trùm qua vị trí nối giữa hai exon. Một trong hai mồi sẽ nằm vắt ngang vị trí nối giữa 2 exon này, khiến cho mồi chỉ bắt cặp đặc hiệu với ADN mà không thể liên kết với ADN tổng số do ở ADN tổng số chứa intron nằm xen giữa các exon. Thiết kế này giúp loại bỏ nguy cơ khuếch đại nhầm ADN tổng số.

Nếu không thể thiết kế mồi chùm qua vị trí nối giữa exon hoặc nằm trên 2 exon được ngăn cách bới intron dài, cần phải xử lý mẫu ARN với enzyme RNAse-free ADNase I hoặc ds-ADNase để loại bỏ ADN tổng số.

Hình 4. Thiết kế đoạn mồi trong RT-PCR

Khác với các phương pháp PCR thông thường hay qPCR chỉ khuếch đại được ADN thì RT-PCR cho phép chúng ta xác định được cả những loại virus, vi khuẩn mang vật chất di truyền là ARN cũng như xác định được trình tự của một đoạn ARN bất kì nào đó một cách dễ dàng hơn.

Đây cũng là một trong những phương pháp được áp dụng nhiều nhất song song với test kháng thể (antibodies) để phục vụ cho truy vết và xét nghiệm một sô loại virus như Zika, HIV, sởi,… nói chung cũng như SARS-CoV-2 đang hoành hành gần đây nói riêng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. ThS. BS. Vũ Thị Thúy Chi, Xét nghiệm PCR có những ưu – nhược điểm gì? Trung tâm Xét nghiệm, Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC, 2019

2. Công ty TNHH Hamesco Việt Nam, Kĩ thuật Real-time PCR là gì? 2019.

3. RT-qPCR – Các nguyên lý cơ bản, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học, Dịch và tổng hợp từ Thermo Scientific BioMedia VN.

4. Nguyễn Thành Khôi, 4 Sự thật gây mất lòng về real-time PCR! Sinh học phân tử.

5. Xét Nghiệm SARS-CoV-2 / COVID-19, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương.

6. Kỹ thuật Realtime PCR – đếm tải lượng virus, vi khuẩn, BioMedia, 2015.

7. chúng tôi Trần Bá Thoại, Uỷ viên BCH Hội Nội tiết Việt Nam, Xét nghiệm PCR trong chẩn đoán Y khoa, Đại học Phan Châu Trinh

Người viết bài:

SV. Vũ Hoài Hương Giang

SV. Hoàng Quốc Cường

Hiệu đính: chúng tôi Ngô Thiện

=====

Để nhận tư vấn về sản phẩm và đặt hàng, vui lòng liên hệ:

CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC PHẨM FYKOFA

Hotline: 1800 234 555 (Miễn phí) Email: info@fykofa.com Website: www.fykofa.com Fanpage: www.fb.com/duocphamFYKOFA