Thẩm Định Quy Trình Định Lượng Paracetamol 650Mg Phóng Thích Kéo Dài Bằng Phương Pháp Quang Phổ Uv

Mẫu chuẩn C: cân chính xác 37,5 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N và 50 mL nước, lắc 15 phút, bổ sung nước cất đến vạch. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Sau đó, hút chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N, thêm nước đến vạch định mức, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 7,5 µg/mL. Mẫu thử T: cân chính xác một lượng bột thuốc khoảng 75 mg paracetamol vào bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT) và 50 mL nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 10 mL dịch lọc đầu. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 100 mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT), thêm nước đến định mức, lắc đều. Mẫu giả lập GL: tiến hành tạo mẫu giả định bằng cách cân tất cả các thành phần trong công thức một viên ứng với 75 mg paracetamol. Mẫu giả định được xử lý tương tự như mẫu thử T trước khi đo quang. Mẫu giả dược GD: mẫu giả dược được tạo ra và xử lý tương tự mẫu giả lập GL (ngoại trừ thành phần không có chứa paracetamol). Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,01 N.

hợp với các tá dược tan được để tạo được lỗ xốp như lactose (Hoàng Ngọc Hùng, 2012). Các tá dược tạo khung thân nước: với cơ chế dùng các polyme không tan nhưng trương nở tạo một lớp gel thân nước bao quanh viên giúp kiểm soát sự phóng thích hoạt chất. Các polyme thân nước hay sử dụng là hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), gôm xanthan, acid polyacrylic (cacbopol) (Hoàng Ngọc Hùng, 2012). 2.4.THỬ NGHIỆM ĐỘ HÒA TAN TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THUỐC Thử nghiệm độ hòa tan là phép thử nhằm đánh giá tốc độ, mức độ giải phóng và hòa tan dược chất ngoài cơ thể. Độ hòa tan phản ánh động học phóng thích hoạt chất của viên và khả năng thuốc sẵn sàng hấp thu khi sử dụng (Mohhamad Hosain và JamesWW. Ayres, 1996). Điều kiện trong phép đo độ hòa tan Thiết bị đo hòa tan: hiện nay có 7 loại thiết bị đo hòa tan được giới thiệu trong Dược Điển các nước (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Trong đó, kiểu giỏ quay và kiểu cánh khuấy là hai kiểu thiết bị đo hòa tan thông dụng nhất. 15 Cácthiết bị này phải đảm bảo các thông số kỹ thuật trong USP 36 và phải được chuẩn hóa (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Tốc độ quay: 50, 75 hay 100 vòng/phút là tùy vào chuyên luận quy định trong các Dược Điển hoặc dạng bào chế và tính chất lý hóa của hoạt chất (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Môi trường: được chỉ dẫn trong từng chuyên luận riêng hay các dung môi hòa tan hoạt chất, tùy thuộc tính của dạng thuốc nghiên cứu (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Thể tích môi trường: thông thường là 500, 750, 900, 1000 mL, phụ thuộc vào tính chất lý hóa và dạng bào chế của hoạt chất (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Thời gian thử nghiệm: tùy theo yêu cầu của từng dạng thuốc (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Vị trí lấy mẫu:ở khoảng giữa bề mặt dung môi và mặt trên cách khuấy, cách thành cốc 1 cm (Robert B. Raffa, 2005). Thời điểm lấy mẫu: đối với thuốc phóng thích kéo dài, mẫu thường được lấy ở ít nhất ba thời điểm để đánh giá độ phóng thích hoạt chất in vitro. Lấy mẫu lần thứ nhất ở thời điểm 1 hay 2 giờ để khẳng định không có sự phóng thích ồ ạt. Mẫu thứ hai thường được lấy ở thời điểm giữa của quá trình để xây dựng đồ thị phóng thích in vitro. Mẫu cuối cùng được chọn lấy vào thời điểm cuối của quá trình để biết phần trăm hoạt chất được phóng thích tối đa. Thời điểm và số lần lấy mẫu được xây dựng dựa trên hồ sơ giải phóng hoạt chất của thuốc (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). 2.5.TỒNG QUAN VỀ QUANG PHỔ UV – VIS Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang học dựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát hoặc sự hấp thụ các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó(Trần Tứ Hiếu, 2008).  Phổ UV – Vis và nguồn gốc của sự hấp thụ(Lê Nhất Tâm, 2014) – Vùng phổ này thường được chia làm 3 vùng chủ yếu: cận UV (185 – 400 nm), khả kiến (400 – 700 nm) và cận hồng ngoại (700 – 1100 nm). – Nguồn gốc của sự hấp thụ trong vùng này chủ yếu là sự tương tác của các photon của bức xạ với các ion hay phân tử của mẫu. – Sự hấp thụ chỉ xảy ra khi có sự tương ứng giữa năng lượng photon và năng lượng các điện tử ngoài cùng (của ion hay phân tử) hấp thụ. – Kết quả của sự hấp thụ là có sự biến đổi năng lượng điện tử của phân tử. Chính vì vậy phổ UV – Vis được gọi là phổ điện tử. 16 – Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng sóng ánh sáng tử ngoại gần (190 – 400 nm) và khả kiến (400 – 780 nm) của các chất gây ra sự chuyển dịch của các điện tử từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. – Biểu đồ biểu diễn sự tương quan giữa cường độ hấp thu theo bước sóng của một chất được gọi là phổ UV- Vis của chất ấy trong điều kiện xác định. – Các quang phổ kế UV – Vis đo độ truyền quang T hay độ hấp thu A của bức xạ khi truyền qua mẫu lỏng. – Độ truyền quang T được tính: T= I I0 Hay: %T = I I0 x 100 – Độ hấp thụ A được xác định: A = -logT – Tùy vào trạng thái của mẫu đo mà phổ thu được có những đường nét khác nhau: Hình 2.12.Đồ thị về đường phổ của hai mẫu khác nhau Chú thích: a: Benzen in solution b: Benzen vapour  Sự chuyển dịch điện tử của các hợp chất hữu cơ – Phần lớn các hợp chất hữu cơ được nghiên cứu trong vùng phổ UV – Vis. – Quá trình chuyển tiếp bao gồm các điện tử π, σ hay điện tử n nằm trên các orbital của các nguyên tử nhẹ như H, C, N, O.  Những yếu tố ảnh hưởng tới sự chuyển mức: Ảnh hưởng của dung môi: – Bước sóng hấp thu và cường độ hấp thu của các hợp chất chịu ảnh hưởng của dung môi. – Sự tác động của những dung môi khác nhau lên các phân tử làm thay đổi mức năng lượng giữa các trạng thái kích thích và cơ bản. 17 – Sự tác động của dung môi lên phân tử làm sinh ra chuyển dịch xanh và chuyển dịch đỏ. Chuyển dịch xanh: + Là hiện tượng hấp thu bức xạ của các hợp chất hữu cơ có bước sóng ngắn hơn trong những dung môi có tính phân cực cao. + Hiện tượng tìm thấy ở quá trình chuyển dịch n π* của nhóm carbonyl. + Nguyên nhân là do sự làm bền trạng thái n của dung môi. Chuyển dịch đỏ + Là hiện tượng các hợp chất hữu cơ có xu hướng hấp thu những bức xạ có bước sóng dài hơn trong những dung môi có độ phân cực cao hơn. + Hiện tượng được tìm thấy ở các phân tử hữu cơ mà trong cấu trúc phân tử của nó có sự liên hợp. + Nguyên nhân do khi mạch C càng dài thì hiệu ứng liên hợp càng tăng, dẫn tới độ lệch năng lượng giữa hai trạng thái giảm và do trong phân tử hữu cơ có hiệu ứng liên hợp càng dài thì bước sóng hấp thu càng lớn. Ảnh hưởng của pH – Ảnh hưởng độ bền của phức. – Ảnh hưởng đến sự tạo phức. – Ảnh hưởng dạng tồn tại. Ảnh hưởng của sự liên hợp Sự liên hợp p-π hay π-π đều làm cho trạng thái kích thích của điện tử π* bền hơn có năng lượng thấp hơn đều này dẫn tới bước sóng hấp thu dài hơn.  Định luật Lambert – Beer: Chiếu một chùm tia đơn sắc song song có cường độ I0 rọi thẳng góc lên bề dày L của một môi trường hấp thụ thì sau khi qua lớp hấp thụ này cường độ của ánh sáng nhỏ đi còn là I (I < I0). Gọi T là độ truyền qua của ánh sáng thì T = I I0 Định luật Lambert – Beer: độ hấp thụ ánh sáng của vật chất tỷ lệ thuận với hai thành phần là nồng độ chất hấp thụ và khoảng đường của ánh sáng truyền qua vật chất. A = -lgT = ε.C.l A: độ hấp thụ l: chiều dày của lớp hấp thụ (cm) C: nồng độ của chất hấp thụ (mol/l) ε: hệ số hấp thụ mol 2.5.1. Cấu tạo máy quang phổ UV-Vis Cấu tạo của máy quang phổ UV – Vis được trình bày ở hình 2.13. 18 Hình 2.13. Cấu tạo máy quang phổ UV-Vis 6800 2.5.1.1.Nguồn sáng Nguồn sáng cho máy quang phổ là chùm bức xạ phát ra từ đèn. Máy quang phổ dùng đèn Hydro hay đèn Deuterium cho phổ phát xạ liên tục trong vùng UV 200- 380nm (nhưng thường sử dụng 200-340nm) và đèn Tungsten Halogen đo vùng 380- 1000nm. Để làm việc cho cả hai vùng thì phải có đủ 2 loại đèn trên. Một yêu cầu đối với nguồn sáng là phải ổn định, tuổi thọ cao và phát bức xạ liên tục trong vùng phổ cần đo. 2.5.1.2.Bộ tạo ánh sáng đơn sắc (monochromator) Bộ đơn sắc có chức năng tách bức xạ đa sắc thành bức xạ đơn sắc, bao gồm kính lọc, lăng kính hay cách tử. Cách tử là một bảng nhôm hay các kim loại Cu, Ag, Au, được vạch thành những rãnh hình tam giác song song. Khi chiếu ánh sáng qua cách tử, phần còn lại có tác dụng tạo nên vân nhiễu xạ có bước sóng khác nhau, khi quay cách tử sẽ tạo ra phổ nhiễu xạ giống như trường hợp ánh sáng qua lăng kính. Ưu điểm là cho độ phân giải tốt, tán sắc tuyến tính, độ rộng của dải ổn định, chọn bướcsóng đơn giản, gọn nhẹ, dễ chế tạo; nên hiện nay sử dụng cách tử tạo ánh sáng đơn sắc được ưa chuộng. Cách tử dùng cho UV-Vis có 1200 vạch/mm (thường dao động từ 300-3600 vạch/mm), số vạch càng nhiều thì năng suất phân giải càng cao. Lăng kính của máy quang phổ dùng lăng kính littrow (lăng kính 30o) bằng thạch anh, có đặc điểm ánh sáng đi qua lăng kính hai lần do phản xạ ở mặt sau. 2.5.1.3.Detector Detector là bộ phận đo tín hiệu ánh sáng trước và sau khi đi qua dung dịch (đựng trong cuvet). Các tín hiệu sau khi đi ra detector sẽ được khuếch đại, lưu giữ và xử lý trên máy tính. 2.5.1.4.Cuvet đựng mẫu Cuvet phải làm bằng chất liệu cho bức xạ ở vùng cần đo đi qua. Cuvet thủy tinh không thích hợp cho vùng UV. Cuvet thạch anh cho bức xạ đi qua từ 190 – 1000 nm. Cuvet nhựa chỉ dùng trong Vis và chỉ sử dụng được 1 vài lần. Quang phổ phát xạ Nguồn sáng + Mẫu Máy đơn sắc Đầu thu Xử lý tín hiệu Huỳnh quang, hấp thu, Raman Nguồn sáng Mẫu  19 2.5.1.5.Bộ khuếch đại tín hiệu (amplificator) 2.5.1.6.Bộ phận ghi Bộ phận ghi hay đồng hồ đo có 2 thang đo bao gồm:  Thang đo độ hấp thụ A hay mật độ quang D (Absorbance, Optical Density).  Thang đo độ thấu quang, độ truyền quang T (Transmittance). 2.5.2. Ưu điểm – Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định nồng độ trong khoảng 10-2 đến 10-6 mol/L (1-10%). – Phân tích thuận tiện: không đòi hỏi thiết bị, hóa chất quá đắt tiền, có thể phân tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau. – Dễ tự động hóa: các thao tác từ đưa mẫu phân tích vào, đưa các hóa chất cần thiết, vẽ phổ, xử lý phổ, xử lý kết quả, xử lý thống kê đều được thực hiện một cách tự động hóa trên các máy móc, thiết bị hiện đại. – Phương pháp này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu các cơ chế tạo phức, xác định các dạng tồn tại của ion trung tâm, các ligand nằm trong phức đơn và đa ligand trong pha nước cũng như pha hữu cơ. 2.5.3. Các sai số trong phép đo Phương pháp phân tích quang phổ cũng như các phương pháp phân tích khác, sai số được chia làm hai loại: sai số do tiến hành phản ứng hóa học (hóa chất, thao tác, dụng cụ), sai số của tín hiệu đo độ hấp thụ của dung dịch (sai số hệ thống). Trong phương pháp quang phổ thì sai số quan trọng nhất là sai số của tín hiệu trong quá trình đo độ hấp thu. 2.5.4. Yêu cầu của chất phân tích Các hợp chất cần xác định phải bền và ít phân ly, ổn định, không thay đổi thành phần trong khoảng thời gian nhất định để thực hiện phép đo (10 – 20 phút). Hệ số ɛcàng lớn càng tốt, nồng độ các chất xác định phải tuân theo định luật Lambert – Beer. Các hợp chất là phức cần đo phải có bước sóng cực đại khác xa bước sóng cực đại của thuốc thử trong cùng điều kiện, tức là khoảng 80 – 100 nm. 2.5.5. Một số ứng dụng Phương pháp phổ UV – Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích định tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng. Nguyên tắc của phương pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch của định luật Lambert – Beer, phương pháp định tính là dựa vào hình dáng của phổ và bước sóng cực đại. 2.5.5.1. Xác định mức độ tinh khiết của hợp chất Nếu hợp chất trong suốt, các vết của tạp chất dễ phát hiện khi chúng có cường độ hấp thu đủ mạnh. 20 Nếu hợp chất có vạch hấp thu ở vùng UV – Vis thì cần tinh chế cho đến khi hệ số phân tử của sự hấp thu đạt giá trị không đổi. 2.5.5.2. Nhận biết và xác định cấu trúc của hợp chất – Nhận biết sản phẩm của sự tổng hợp bằng cách so sánh đường cong hấp thu của sản phẩm tổng hợp với đường cong hấp thu của sản phẩm thiên nhiên hay mẫu chuẩn. – Nhận biết nhóm chức của hợp chất dựa vào quang phổ, các thông tin về các nguyên tố và phản ứng định tính các nhóm chức. Có thể sử dụng cường độ vạch hấp thu với mục đích nhận dạng trong trường hợp chất tinh khiết. – Nhận biết cấu tạo của hợp chất ban đầu dựa vào số liệu hấp thu của các dẫn xuất hay sản phẩm phân hủy của nó. – Xác định đồng phân hình học, dạng trans có λmax, 𝜀max lớn hơn dạng cis. – Xác định sự đồng phân do sự hỗ biến enol – keton, thiol – thion. 2.5.5.3. Phân tích hỗn hợp – Định tính và định lượng hỗn hợp. – Điều kiện để có kết quả xác đáng: chất phân tích tuân theo định luật Lambert- Beer, đã biết hệ số hấp thu của mỗi hợp chất tinh khiết. 2.5.5.4. Xác định trong lượng phân tử Khi hợp chất ban đầu không hấp thu trong vùng sóng này, nếu nó phản ứng với tác nhân có vạch hấp thu đặc trưng, cường độ mạnh và độ dài sóng thì hệ số hấp thu của chất dẫn xuất thu được không khác hệ số của tác nhân. Nếu hệ số hấp thu này là không đổi trong bất cứ dẫn xuất nào thì mật độ quang học D sẽ phụ thuộc vào M của chất ban đầu. 𝑀 = 𝜀.𝜔.𝑙 𝐷 Trong đó 𝜔 nồng độ chất L chiều dày cuvet 2.5.5.5. Xác định hằng số phân ly của acid, base Ví dụ:HB + H2O ↔ H3O+ +B- 𝑝𝐾𝑎 = 𝑝𝐻 + 𝑙𝑔 CHB CB− Quang phổ được sử dụng để xác định lg CHB CB− , đo pH của dung dịch sẽ suy ra p𝐾𝑎. 2.5.5.6. Nghiên cứu phản ứng hóa học – Theo dõi biến đổi nồng độ các chất trong phản ứng. – Xác định vận tốc phản ứng. – Xác định nhiệt sinh của các phân tử không bền. – Thiết lập công thức thực nghiệm và hằng số tạo phức trong dung dịch. 2.6.THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra, cung cấp bằng 21 chứngkhách quan để chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the urpose). Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy (Trần Cao Sơn ctv, 2010). 2.6.1.Khi nào cần thẩm định(Hoàng Ngọc Hùng, 2012) – Sử dụng một phương pháp mới vào công việc phân tích hằng ngày. – Thay đổi mục đích sử dụng của phương pháp. – Giới hạn thu được sau khi phân tích nằm ngoài giới hạn quy định. – Thay đổi quy trình: thành phần tá dược trong thuốc, trang thiết bị, thông số kỹ thuật, thay đổi nhà cung cấp hóa chất. 2.6.2.Tầm quan trọng của việc thẩm định(Bộ Y tế, 2011;Nguyễn Lầu Hai, 2014;Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008). Thẩm điṇh quy trình phân tích là môṭ quá trình tiến hành thiết lâp̣ bảng thưc̣ nghiêṃ của các thông số đăc̣ trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dư ̣kiến. Nói cách khác, việc thẩm điṇh môṭ quy trình phân tích yêu cầu chúng ta chứng minh môṭ cách khoa hoc̣ rằng khi tiến hành thí nghiêṃ sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhâṇ đươc̣. Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dưṇg phương pháp phân tích hay cũng goị là quy trình thử nghiêṃ để giúp cho viêc̣ kiểm tra chất lươṇg cũng như các tiêu chí đề ra cho các tiêu chuẩn đó. Muc̣ tiêu của viêc̣ thẩm điṇh các phương pháp phân tích là để chứng tỏ rằng quy trình đáp ứng với nhu cầu dư ̣kiến. Phương pháp phân tích sau khi thẩm điṇh có thể đưa vào Dươc̣ điển hoăc̣ đưa vào các tiêu chuẩn cơ sở để xin đăng ký lưu hành. 2.6.3.Nội dung thẩm định(Bộ Y tế, 2013; Đặng Văn Giáp, 2012; Trần Tử An, 2005) Cơ sở cần thiết cho viêc̣ thẩm điṇh phương pháp phân tích để điṇh lươṇg những thành phần chủ yếu trong nguyên liêụ thuốc, hoaṭ chất trong các chế phẩm cần dưạ vào các tiêu chuẩn sau: – Độ đặc hiệu – Tính tuyến tính – Đô ̣lăp̣ laị – Đô ̣đúng 2.6.3.1. Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu: là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tạp chất, sản phẩm phân hủy,) có trong mẫu thử. Tùy đối tượng trong quy trình phân tích mà thực hiện 22 thử nghiệm. Trong quy trình định lượng tính đặc hiệu biểu thị bằng độ chênh lệch hay là hiệu giữa các kết quả thu được từ một mẫu giả định với các kết quả thu được từ mẫu thử. Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp. Độ nhiễu càng thấp, tính đặc hiệu càng cao. Cách thực hiện:chuẩn bị một mẫu giả định có công thức và thành phần các chất hoàn toàn giống như mẫu thử và mẫu trắng tức là mẫu bao gồm các thành phần giống hệt như mẫu thử nhưng không chứa hoạt chất cần định lượng. Yêu cầu: Sự sai khác giữa hai hệ số góc không quá 2%, chứng tỏ quy trình có tính chọn lọc với chất phân tích. 2.6.3.2. Tính tuyến tính Tính tuyến tính của môṭ phương pháp phân tích là khả năng luâṇ ra các kết quả thử của phương pháp hoăc̣ bằng phép biến đổi toán hoc̣ hay trưc̣ tiếp dưạ vào tương quan tỷ lê ̣giữa đaị lươṇg đo và nồng đô.̣ Tính tuyến tính trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương quan R. Cách thưc̣ hiêṇ: tiến hành thưc̣ nghiêṃ để xác điṇh ứng với các nồng đô ̣x biết trước, các giá tri ̣ điṇh lươṇg đươc̣ y. Như ta đa ̃biết nếu y phu ̣thuôc̣ tuyến tính vào x có nghiã là trong khoảng nồng đô ̣cần khảo sát đường biểu diêñ của y theo x là môṭ đường thẳng theo phương trình sau: y=ax+b. Dưạ vào kết quả thu đươc̣ từ thưc̣ nghiêṃ của x và y tương ứng ta tính hê ̣số tương quan R: 𝑅 = ∑(𝑥 − �̅� ) × (𝑦 − �̅�) √∑(𝑥 − �̅�)2 × ∑(𝑦 − �̅�)2 Nếu: R=1: có tính tương quan tuyêṭ đối. R<0: có tương quan nghic̣h biến. R=0: hoàn toàn không có tương quan tuyến tính. Sau khi xác nhâṇ đươc̣ khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xây dưṇg phương pháp hồi quy của khoảng này tức là xác điṇh hê ̣số a và b của phương trình trên: 𝑎 = ∑ 𝑥𝑦 − ∑ 𝑥 ∑ 𝑦 𝑛⁄ ∑ 𝑥2 − (∑ 𝑥) 2 𝑛⁄ ; 𝑏 = 𝑦 − 𝑎𝑥 y: giá tri ̣ điṇh lươṇg đươc̣. x: nồng đô ̣điṇh lươṇg. Phương trình hồi quy: 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 Yêu cầu: tùy theo hoac̣h điṇh mà choṇ giá tri ̣ R. 23 2.6.3.3. Đô ̣lăp̣ laị Đô ̣lăp̣ laị (hay đô ̣chính xác) là mức đô ̣sát gần giữa các kết quả thử riêng lẻ với giá tri ̣ trung bình �̅�thu đươc̣ khi áp duṇg phương pháp đề xuất cho cùng môṭ mâũ thử đồng nhất trong cùng điều kiêṇ xác điṇh. Đô ̣lăp̣ laị bi ̣ ảnh hưởng bởi sai số ngâũ nhiên. Đô ̣lăp̣ laị thường đươc̣ biểu hiêṇ bằng đô ̣lêc̣h chuẩn (SD) hay đô ̣ lêc̣h chuẩn tương đối (RSD) của môṭ loaṭ các lần thử nghiêṃ. Cách thưc̣ hiêṇ: độ lặp lại được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu 3 nồng độ hoặc thực hiện định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%. Sau đó áp duṇg công thức tính SD và RSD của phương pháp. Yêu cầu:RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiêṃ đưa ra, thông thường ta choṇ RSD ≤ 2%. SD = √ ∑(𝑥𝑖 −𝑋) 2 𝑛−1 𝑅𝑆𝐷 = 𝑆𝐷 𝑋 × 100% 𝑋 = ∑ 𝑥𝑖 𝑛 X: giá tri ̣ trung bình 2.6.3.4. Đô ̣đúng Đô ̣đúng của môṭ phương pháp phân tích là mức đô ̣sát gần của giá tri ̣ tìm thấy với giá tri ̣ thưc̣, khi áp duṇg quy trình đề xuất trên cùng môṭ mẫu thử đa ̃ đươc̣ làm đồng nhất trong điều kiêṇ xác điṇh. Đô ̣đúng bi ̣ ảnh hưởng bởi sai số hê ̣ thống. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm thấy so với lượng chất chuẩn thêm vào. Cách thưc̣ hiêṇ: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu 3 nồng độ. Từ kết quả thu được xác định tỷ lệ % tìm lại của chất đem thử: Đ = 𝜇 𝑥 × 100% Đ: tỉ lê ̣phuc̣ hồi. μ : hàm lươṇg tìm laị. x : hàm lươṇg chất chuẩn thêm vào. Yêu cầu: Tỉ lê ̣phuc̣ hồi trung bình phải đaṭ: 97% ≤ ĐTB ≤ 103%. 2.7. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN Andrew D. Trafford, Roger D. Jee và các cộng sự (1999) đã sử dụng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng paracetamol trong nhiều chế phẩm. Kết quả phương pháp cho thấy khả năng lặp lại tốt, độ lệch chuẩn và hệ số biến thể cho 6 lần so sánh trong cùng một lô cùng một ngày là 0,14 và 0,16%, sai lệch trung bình -0,22% và độ chính xác trung bình là 0,45% (Andrew D. Trafford et al., 1999). 24 Ramesh Sawant, Lokesh Bhangale và các cộng sự (2010) đã định lượng paracetamol bằng phương pháp quang phổ. Phương pháp sử dụng NaOH 0,1M làm dung môi, đo độ hấp thu tại bước sóng 256 nm. Phương pháp nghiên cứu có ý nghĩa thống kê vì tất cả các thông số đều nằm trong khoảng chấp nhận được. Ưu điểm phương pháp đơn giản, nhanh chóng và chính xác (Ramesh Sawant et al., 2010). 25 CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ 3.1.1. Nguyên liệu Các nguyên liệu, chất chuẩn, tá dược và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong các bảng 3.1; 3.2 và 3.3. Bảng 3.1. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng Paracetamol USP Malinkrodt (Mỹ) Hoạt chất Paracetamol chuẩn (Hàm lượng 99,72%) Chất chuẩn Viện KN TPHCM Chất chuẩn Bảng 3.2. Các tá dược dùng trong nghiên cứu Tên tá dược Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng PVP K30 USP Mỹ Tá dược dính Avicel 101 BP Đài Loan Tá dược độn DST BP Đài Loan Tá dược rã HPMC K15M USP Nhật Tạo khung matrix Magnesi stearat BP Malaysia Tá dược trơn bóng Bảng 3.3. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Tên hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng Nước cất Nhà sản xuất Việt Nam Pha dung dịch đệm Acid phosphoric Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm Dinatri hydrophosphat Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm Kali dihydrophosphat Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm Natri hydroxyd Nhà sản xuất Trung Quốc Dung môi pha mẫu 3.1.2.Trang thiết bị trong bảng 3.4. STT Tên thiết bị Mã hiệu Nguồn gốc 1 Cân phân tích AND HR200 Nhật 2 Máy UV-Vis Shimazdu 1800 Nhật 3 4 Máy thử độ hòa tan Máy siêu âm Pharma Test PTW3C Elma T840DH Đức Đức 5 Máy đo pH Hanna Hi 2210 Mỹ 3.1.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu Phòng thí nghiệm bộ môn Bào chế, Kiểm Nghiệm – Khoa Dược, Trường Đại Học Tây Đô. Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2024 đến 06/2024. 26 3.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trước khi thẩm định, tiến hành định tính nguyên liệu paracetamol bằng cách đo bước sóng cực đại hấp thu của mẫu nguyên liệu với mẫu chuẩn bằng phương pháp đo quang UV – Vis. 3.2.1.Quytrình định lượng paracetamol trong chế phẩm Khảo sát quy trình định lượng paracetamol thông qua tham khảo chuyên luận “viên nén paracetamol” trong Dược điển Việt Nam IV, điều chỉnh các bước tiến hành cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm hiện có. Sau đó, tiến hành thẩm định quy trình định lượng theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam (Bộ Y tế, 2013). Phương pháp xử lý mẫu: Mẫu chuẩn C: cân chính xác 37,5 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N và 50 mL nước, lắc 15 phút, bổ sung nước cất đến vạch. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Sau đó, hút chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N, thêm nước đến vạch định mức, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 7,5 µg/mL. Mẫu thử T: cân chính xác một lượng bột thuốc khoảng 75 mg paracetamol vào bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT) và 50 mL nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 10 mL dịch lọc đầu. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 100 mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT), thêm nước đến định mức, lắc đều. Mẫu giả lập GL: tiến hành tạo mẫu giả định bằng cách cân tất cả các thành phần trong công thức một viên ứng với 75 mg paracetamol. Mẫu giả định được xử lý tương tự như mẫu thử T trước khi đo quang. Mẫu giả dược GD: mẫu giả dược được tạo ra và xử lý tương tự mẫu giả lập GL (ngoại trừ thành phần không có chứa paracetamol). Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,01 N. Tính đặc hiệu Tiến hành: thẩm định tính đặc hiệu tiến hành trên 2 mẫu giả lập GL và giả dược GD. Đo độ hấp thu của hai mẫu trên tại bước sóng 257 nm. Ghi nhận kết quả và tính tỷ lệ giữa độ hấp thu của mẫu GD/GL. Yêu cầu: quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu khi tỷ lệ độ hấp thu của mẫu GD/GL không quá 2%. 27 Khoảng tuyến tính và miền giá trị Tiến hành: tiến hành pha dung dịch paracetamol chuẩn gốc có nồng độ khoảng 75 ppm. Từ đó, pha loãng dung dịch này thành các dung dịch chuẩn thứ cấp theo dãy nồng độ 30 ppm; 15 ppm; 7,5 ppm; 3,75 ppm; 1,5ppm và 0,75 ppm. Lần lượt đo độ hấp thu của các dung dịch chuẩn ở bước sóng 257 nm. Dựa vàokết quả độ hấp thu, xác định phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan bình phương (r2). Yêu cầu: r2 ≥ 0,995 quy trình đạt tính tuyến tính và miền giá trị xác định trong khoảng tuyến tính khảo sát. Độ chính xác Tiến hành: chuẩn bị mẫu thử tương tự như ở mục xử lý mẫu (mẫu T). Thực hiện với 6 mẫu độc lập. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu trên ở bước sóng 257 nm. Ghi nhận kết quả độ hấp thu, tính toán hàm lượng paracetamol có trong từng mẫu và RSD giữa 6 mẫu. Yêu cầu: quy trình đạt độ chính xác khi kết quả định lượng paracetamol trên 6 mẫu có RSD ≤ 2%. Độ đúng Tiến hành: tạo các mẫu giả lập bằng cách thêm chuẩn paracetamol tương ứng với 90, 100 và 110% vào mẫu tá dược. Mỗi mức hàm lượng thực hiện với 3 mẫu độc lập. Cách xử lý mẫu tương tự mẫu thử T. Xác định hàm lượng paracetamol bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 257 nm. Sau đó, tính tỷ lệ hồi phục bằng cách so sánh lượng paracetamol tính toán được với lượng cân thực tế ban đầu. Yêu cầu: quy trình phân tích đạt độ đúng khi tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ và tỷ lệ phục hồi trung bình chung nằm trong giới hạn cho phép: 97 – 103%. 3.2.2.Quy trình định lượng paracetamol trong phép đo hòa tan Điều kiện đo hòa tan: – Thiết bị đo hòa tan: kiểu cánh khuấy (loại II theo USP 36). – Thể tích môi trường: 900 mL. – Môi trường hòa tan: môi trường pH khảo sát: 4,5. – Nhiệt độ môi trường: 37 ± 0,5oC. – Tốc độ cánh khuấy: 50 vòng/phút. – Thời điểm lấy mẫu: 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ. – Thể tích lấy mẫu: 20 mL. Xử lý mẫu:lọc dịch hòa tan qua giấy lọc thường, bỏ vài mL dịch lọc đầu, lắc đều. Rút 1 mL dịch lọc vào bình định mức 100 mL, bổ sung NaOH 0,1 N vừa đủ, lắc đều. 28 Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,1 N. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu thử và mẫu chuẩn. Thẩm định quy trình đo hòa tan Tính đặc hiệu:quy trình đạt độ đặc hiệu khi độ hấp thu của mẫu giả dược so với mẫu giả định tại các thời điểm khảo sát đều không quá 2% theo Sổ tay đăng kýthuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. Tính tuyến tính: chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,75 – 30 ppm. Phương trình hồi quy đạt độ tuyến tính khi r2 ≥ 0,98 theo USP 36. Độ đúng: cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàm lượng bằng 50%, 80% và 100% hàm lượng ghi trên nhãn. Quy trình phân tích đạt độ đúng khi tỉ lệ phục hồi ở từng mức nồng độ nằm trong giới hạn cho phép 95 – 105% theo USP 36. Độ chính xác: từ kết quả của độ đúng, tính RSD của các kết quả thu được ở từng mức độ. Quy trình phân tích độ chính xác đạt khi giá trị thống kê độ hấp thu trên 3 mẫu/nồng độ có RSD ≤ 10% ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ, RSD ≤ 5% ở thời điểm 3 giờ theo USP 36. 3.2.3. Khảo sát viên Tylenol trên thị trường Tiến hành quét phổ mẫu chuẫn và Tylenol 650 mg Extended Release. Pha mẫu như ở mục 3.2.1 tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 257 nm. Xử lý số liệu, xác định hàm lượng Tylenol 650 mg Extended Release. 29 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ 4.1. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG CHẾ PHẨM Trước khi tiến hành thẩm định, ta khảo sát nguyên liệu paracetamol so với mẫu chuẩn. Kết quả định tính nguyên liệu paracetamol được trình bày ở hình 4.1. Hình 4.1. Kết quả định tính nguyên liệu paracetamol 4.1.1.Độ đặc hiệu Phổ UV của mẫu chuẩn, mẫu giả lập và mẫu giả dược được trình bày ở hình 4.2. Hình 4.2. Overlay phổ UV của mẫu giả dược, mẫu giả lập và mẫu chuẩn QUÉT PHỔ CHUẨN QUÉT PHỔ GIẢ DƯỢC QUÉT PHỔ GIẢ LẬP QUÉT PHỔ CHUẨN QUÉT PHỔ NGUYÊN LIỆU 30 Qua đường biểu diễn độ hấp thu của mẫu giả lập và mẫu chuẩn so với mẫu giả dược thể hiện rằng paracetamol cho đỉnh hấp thu đặc trưng ở bước sóng 257 nm. Như vậy phương pháp định lượng paracetamol bằng phương pháp đo quang có tính đặc hiệu. Kết quả độ đặc hiệu được trình bày như ở bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả độ đặc hiệu Độ hấp thu Ảnh hưởng tá dược (%) Mẫu giả dược Mẫu giả định 0,001 0,540 0,19 Nhận xét: Tại bước sóng 257 nm, tá dược có hấp thu, nhưng độ hấp thu của tá dược với mẫu giả định nhỏ hơn 2%. Vậy phương pháp phân tích cho phép xác định chính xác và đặc hiệu hoạt chất paracetamol mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của chất khác có trong mẫu thử theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.1.2. Tính tuyến tính – miền giá trị Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ paracetamol được trình bày trong bảng 4.2 và hình 4.3. Bảng 4.2. Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ Nồng độ (mg/l) 0,75 1,50 3,75 7,50 15,00 30,00 Độ hấp thu 0,051 0,103 0,266 0,539 1,075 2,149 Đ ộ h ấ p t h u y = 0.0717497x – 0.00240881 R² = 0.99999 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 5 10 15 20 25 30 35 Nồng độ (µg/mL) 31 Nhận xét: Dựa trên đồ thị ta thấy khoảng nồng độ từ 0,75 – 30,00 mg/l có sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang là rất tốt. Đồng thời so sánh hệ số tương quan R của của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.1.3.Độ chính xác Kết quả độ chính xác được trình bày như ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả độ chính xác Mẫu Độ hấp thu Nồng độ Hàm lượng (mg) % Hàm lượng Kết quả 1 0,533 7,46 648,30 99,74 SD = 1,7512 x 10-3 RSD = 0,3269% 2 0,535 7,49 650,16 100,02 3 0,536 7,50 650,29 100,04 4 0,537 7,52 651,28 100,20 5 0,535 7,49 650,16 100,02 6 0,538 7,53 650,66 100,10 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của 6 lần thử nhỏ hơn 2%. Vậy quy trình phân tích đạt về độ chính xác theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.1.4.Độ đúng Kết quả độ đúng được trình bày như ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả độ đúng Mẫu STT Lượng chất chuẩn thêm vào (mg) Độ hấp thu Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 90% 1 33,9 0,482 33,8 99,71 2 33,5 0,477 33,4 99,70 3 33,7 0,480 33,6 99,70 �̅� 99,70 RSD (%) 0,52 100% 1 37,3 0,525 36,8 98,66 2 37,8 0,535 37,5 99,21 3 37,6 0,531 37,2 98,94 �̅� 98,94 RSD (%) 0,95 110% 1 41,3 0,588 41,2 99,76 2 40,9 0,582 40,8 99,76 3 40,7 0,580 40,6 99,75 �̅� 99,76 RSD (%) 0,71 TRUNG BÌNH 99,47 RSD (%) 0,73 32 4.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG PHÉP ĐO HÒA TAN 4.2.1. Độ đặc hiệu Kết quả độ đặc hiệu được trình bày như ở bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả độ đặc hiệu ở môi trường pH 4,5 Thời gian Độ hấp thu Ảnh hưởng tá dược (%) Mẫu giả dược Mẫu giả lập 15 phút 0,003 0,528 0,57 30 phút 0,003 0,535 0,56 1 giờ 0,006 0,538 1,12 2 giờ 0,008 0,542 1,48 3 giờ 0,008 0,551 1,45 Nhận xét: Tại bước sóng 257 nm, tá dược có sự hấp thu, nhưng độ hấp thu của tá dược với mẫu giả lập nhỏ hơn 2%. Vậy phương pháp phân tích cho phép xác định chính xác và đặc hiệu hoạt chất paracetamol ở môi trường pH 4,5 mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của chất khác có trong mẫu thử theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.2.2. Tính tuyến tính Môi trường pH 4,5 Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ paracetamol ở môi trường pH 4,5 được trình bày trong bảng 4.6 và hình 4.4. Bảng 4.6. Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ ở môi trường pH 4,5 Nồng độ (mg/l) 0,75 1,50 3,75 7,50 15,00 30,00 Độ hấp thu 0,052 0,104 0,266 0,538 1,079 2,161 Hình 4.4. Đồ thị khảo sát tính tuyến tính của paracetamol ở môi trường pH 4,5 y = 0.0721525x – 0.00357426 R² = 1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 5 10 15 20 25 30 35 Đ ộ h ấ p t h u Nồng độ (µg/mL) 33 Nhận xét: Dựa trên đồ thị ta thấy khoảng nồng độ từ 0,75 – 30,00 mg/l có sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang là rất tốt. Đồng thời so sánh hệ số tương quan R của 36. 4.2.3.Độ chính xác Kết quả độ chính xác được trình bày như ở bảng 4.7. Bảng 4.7 Kết quả độ chính xác Thời gian 15 phút 30 phút 1 giờ 2 giờ 3 giờ Mẫu Độ hấp thu 1 0,527 0,532 0,536 0,542 0,550 2 0,526 0,533 0,537 0,540 0,551 3 0,527 0,533 0,537 0,542 0,548 4 0,528 0,534 0,536 0,541 0,550 5 0,528 0,533 0,538 0,542 0,547 6 0,527 0,531 0,535 0,539 0,549 RSD (%) 0,14 0,19 0,20 0,23 0,27 TRUNG BÌNH 0,206 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ nhỏ hơn 10%; ở thời điểm 3 giờ RSD < 5%. Vậy quy trình phân tích đạt độ chính xác ở môi trường pH 4,5 theo USP 36. 4.2.4. Độ đúng Kết quả độ đúng được trình bày như ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Kết quả độ đúng Mẫu STT Lượng chất chuẩn thêm vào (mg) Độ hấp thu Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 50% 1 325,4 0,260 328,1 100,83 2 325,1 0,256 324,2 99,72 3 325,0 0,255 322,3 99,17 �̅� 99,91 RSD (%) 1,03 80% 1 520,2 0,416 523,8 100,69 2 520,1 0,415 521,9 100,35 3 519,9 0,413 519,0 99,83 �̅� 100,29 RSD (%) 0,37 100% 1 650,4 0,523 656,7 100,97 2 650,5 0,524 657,7 101,1 3 649,8 0,512 643,5 99,03 �̅� 100,46 RSD (%) 1,28 TRUNG BÌNH 100,22 RSD (%) 0,89 34 Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi ở cả 3 mức nồng độ trong môi trường pH 4,5 nằm trong khoảng 95 – 105%. Vậy quy trình phân tích đạt về độ đúng theoUSP 36. 4.3. KHẢO SÁT VIÊN TYLENOL Tiến hành thử nghiệm viên Tylenol 650 mg Extended Release. Phổ mẫu chẩn và phổ mẫu Tylenol Extended Release trình bày ở hình 4.5. Hình 4.5. Overlay phổ UV của mẫu chuẩn và Tylenol 650 mg Extended Release Nhận xét: Sau khi quét phổ thấy được đường phổ của mẫu Tylenol 650 mg Extended Release gần với đường phổ của mẫu chuẩn. Hàm lượng Tylenol Extended Release được trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9. Hàm lượng của viên Tylenol ở lô thử nghiệm Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng (mg) Hàm lượng viên (%) 1 0,529 648,4 99,75 2 0,529 648,4 99,75 3 0,528 647,4 99,60 4 0,528 647,4 99,60 5 0,528 647,4 99,60 6 0,532 649,7 99,95 KẾT QUẢ 99,71 QUÉT PHỔ CHUẨN QUÉT PHỔ TYLENOL 35 CHƯƠNG 5. THẢO LUẬN Nguyên liệu paracetamol đã được kiểm tra, định tính bằng cách chồng phổ UV – Vis giữa mẫu nguyên liệu với mẫu chuẩn. Nguyên liệu có hàm lượng 99,72% paracetamol. Đề tài đã tiến hành quy đổi lượng nguyên liệu để có được hàm lượng paracetamol như đúng yêu cầu của hàm lượng viên. 5.1.THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS Sau khi tham khảo chuyên luận “viên nén paracetamol” trong Dược điển Việt Nam IV, chúng tôi tiến hành điều chỉnh các bước sao cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm hiện có. Sau quá trình khảo sát, đánh giá thực nghiệm cho thấy quy trình phù hợp, đáp ứng được yêu cầu định lượng viên nén paracetamol 650 mg PTKD. Chúng tôi đã tiến hành thẩm định quy trình định lượng đã thiết kế theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. 5.1.1.Độ đặc hiệu Để chứng minh được quy trình định lượng có tính chọn lọc cao hay nói cách khác là các yếu tố khác (nếu có) như tá dược, dung môi không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả định lượng paracetamol. Chúng tôi tiến hành song song hai mẫu: mẫu giả dược (có thành phần giống như công thức nhưng không có paracetamol) và mẫu giả lập (có thành phần hoàn toàn giống với công thức bao gồm cả paracetamol). Tiến hành xử lý mẫu và đo độ hấp thu trong cùng điều kiện. Kết quả cho thấy rằng tại cực đại hấp thu của paracetamol 257 nm thì mẫu giả dược vẫn có hấp thu. Tuy nhiên, độ hấp thu này so với mẫu giả lập là không quá 2% đáp ứng theo yêu cầu của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đã đạt độc đặc hiệu. 5.1.2.Tính tuyến tính So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta thấy Việt Nam. Do đó có thể dùng phương trình hồi quy y = 0.0717497x – 0.00240881 để định lượng paracetamol 650 mg PTKD ở khoảng nồng độ 0,75 – 30,00 mg/l. 5.1.3.Độ chính xác Kết quả 6 lần định lượng cho RSD ≤ 2% nằm trong giới hạn cho phép theo quy định của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam, cho thấy sự lặp lại trong thao tác của người phân tích. 5.1.4.Độ đúng Quy trình định lượng cho kết quả tỷ lệ hồi phục ở mỗi nồng độ riêng biệt 90%, 100%, 110% và tỷ lệ hồi phục trung bình đều nằm trong giới hạn yêu cầu từ 97,0 – 36 103,0% của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đảm bảo được tính nguyên vẹn của mẫu, trong quá trình pha mẫu khảo sát, hàm lượng hoạt chất đã mất đi không đáng kể do thao tác hoặc bị giữ lại trên vật liệu lọc. 5.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG PHÉP ĐO HÒA TAN Theo FDA, thử nghiệm độ hòa tan in vitro được áp dụng cho các chế phẩm phân liều dạng rắn nhằm xác định lượng hoạt chất hòa tan trong môi trường lỏng cóthể tích nhất định, trong khoảng thời gian định trước, sử dụng các thiết bị chuyên biệtnhằmkiểm soát một cách thận trọng các thông số của thử nghiệm độ hòa tan. Đề tài đã tham khảo điều kiện đo hòa tan cho viên nén paracetamol trong Dược điển Việt Nam IV và chuyên luận “viên nén phóng thích kéo dài acetaminophen” trong USP 36. Chúng tôi tiến hành điều chỉnh các bước sao cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm hiện có. Sau quá trình khảo sát, đánh giá thực nghiệm cho thấy quy trình phù hợp, đáp ứng được yêu cầu định lượng trong phép đo độ hòa tan của viên nén paracetamol 650 mg PTKD. Có nhiều hướng dẫn về thẩm định quy trình định lượng (bao gồm định lượng cho phép đo hòa tan), nhưng chỉ có hướng dẫn của USP là cụ thể và riêng biệt cho đo hòa tan. Tuy cách tiến hành theo hướng dẫn của USP phức tạp hơn so với các hướng dẫn khác như ICH, FDA hay Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam nhưng khoảng yêu cầu cho phép rộng hơn. Trong phép đo hòa tan có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả như hoạt chất, tá dược, quá trình sản xuất, tình trạng viên khi đo, viên dính vào thành cốc, tốc độ cánh khuấy hay sự phân tán của hoạt chất trong môi trường đo hòa tan. Tất cả yếu tố kể trên ảnh hưởng đến kết quả đo hòa tan rất nhiều và do đó mà độ lặp lại trong kết quả đo hòa tan thấp. Khoảng cho phép rộng hơn theo USP giúp cho quá trình thẩm định dễ dàng hơn. Chính vì thế, đề tài này tiến hành thẩm định quy trình định lượng paracetamol trong phép đo độ hòa tan theo USP. 5.2.1. Độ đặc hiệu Để chứng minh được quy trình định lượng có tính chọn lọc cao hay nói cách khác là các yếu tố khác (nếu có) như tá dược, dung môi pha mẫu hay môi trường hòa tan không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả định lượng paracetamol. Chúng tôi tiến hành đo độ hòa tan song song hai mẫu ở môi trường pH 4,5: mẫu giả dược và mẫu giả lập. Tiến hành xử lý mẫu và đo độ hấp thu ở từng thời điểm khảo sát (15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ) trong cùng điều kiện. Kết quả cho thấy rằng cực đại hấp thu của paracetamol tại 257 nm thì mẫu giả dược vẫn có hấp thu. Tuy nhiên, độ hấp thu này so với mẫu giả lập là không quá 2% đáp ứng theo yêu cầu của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đã đạt độ đặc hiệu. 37 5.2.2 Tính tuyến tính Viên nén paracetamol 650 mg PTKD có mức độ giải phóng hoạt chất tại thời điểm đầu là khoảng 50% và thời điểm cuối là khoảng gần 100%. Đối với tính tuyến tính và miền giá trị trong phép đo độ hòa tan thì yêu cầu phải xây dựng rộng hơn ±20% so với nồng độ thấp nhất và cao nhất tức là trong phép đo độ hòa tan này phải xây ít nhất là từ 30% – 120%. So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta thấy y=0.0721525x – 0.00357426 để định lượng paracetamol 650 mg PTKD ở khoảng nồng độ 0,75 – 30,00 mg/l. 5.2.3.Độ chính xác Kết quả 6 lần định lượng sau các khoảng thời gian đều cho RSD ≤ 5% nằm trong giới hạn cho phép theo quy định của USP 36, cho thấy sự lặp lại trong thao táccủa người phân tích. 5.2.4. Độ đúng Quy trình định lượng cho kết quả tỷ lệ hồi phục ở mỗi nồng độ riêng biệt 50%, 80%, 100% và tỷ lệ hồi phục trung bình đều nằm trong giới hạn yêu cầu từ 95,0 – 105,0% của USP 36. Như vậy, quy trình đảm bảo được tính nguyên vẹn của mẫu, trong quá trình pha mẫu khảo sát, hàm lượng hoạt chất đã không bị mất đi đáng kể do thao tác hoặc bị giữ lại trên vật liệu lọc. 5.3.KHẢO SÁT VIÊN TYLENOL TRÊN THỊ TRƯỜNG Viên đạt tất cảchỉ tiêu chất lượng đề ra như hình thức cảm quan, định tính, định lượng. Hàm lượng paracetamol trong viên đạt so với yêu cầu chỉ tiêu chất lượng. Độ lặp lại và hàm lượng paracetamol trong viên Tylenol trong lô thử nghiệm được trình bày ở bảng 5.1. Bảng 5.1. Khảo sát độ lặp lại và hàm lượng paracetamol trong viên Tylenol 650 mg Extended Release Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng (mg) Hàm lượng viên (%) 1 0,529 648,4 99,75 2 0,529 648,4 99,75 3 0,528 647,4 99,60 4 0,528 647,4 99,60 5 0,528 647,4 99,60 6 0,532 649,7 99,95 KẾT QUẢ SD = 1,5492 x 10-3 RSD = 0,2929% 99,71 Kết quả cho thấy rằng phương pháp UV – Vis có thể giúp định lượng chính xác và sát gần với giá trị thực hàm lượng paracetamol trong dịch hòa tan mà không bị ảnh 38 hưởng bởi các tá dược. Như vậy, có thể sử dụng quy trình đã thẩm định để tiến hành định lượng paracetamol trong phép đo độ hòa tan. Cả hai phương pháp định lượng trong chế phẩm và trong độ hòa tan viên nén paracetamol phóng thích kéo dài đều sử dụng phương pháp UV – Vis. Với các số liệu chứng minh trong thẩm định quy trình phân tích cho phép phương pháp có thể áp dụng để định lượng. Mặt khác, phương pháp này có nhiều ưu điểm: đơn giản, tiện lợi, cho kết quả nhanh chóng, chính xác và tiết kiệm chi phí. 39 CHƯƠNG 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6.1.KẾT LUẬN Sau một thời gian thực nghiệm thẩm định quy trình định lượng paracetamol 650 mg bằng phương pháp quang phổ UV – Vis đã thu được một số kết quả sau: Phương pháp định lượng trong chế phẩm đạt về các yêu cầu theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam: – Độ đặc hiệu: quy trình định lượng có tính chọn lọc cao (độ hấp thu của mẫu giả dược so với mẫu giả lập không quá 2%). – Tính tuyến tính: xây dựng được phương trình hồi quy với hệ số tuyến tính cao – Độ lặp lại: sai số tương đối (hoặc độ lệch chuẩn tương đối) đạt ≤ 2%. – Độ đúng: khả năng tìm lại nằm trong khoảng 97 – 103%. Phương pháp định lượng trong phép đo hòa tan đạt về các yêu cầu theoUSP 36: – Độ đặc hiệu: độ hấp thu của mẫu giả dược so với mẫu giả lập không quá 2%. – Tính tuyến tính: xây dựng được phương trình hồi quy với hệ số tuyến tính cao – Độ lặp lại: đạt ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ RSD < 10%, 3 giờ RSD < 5%. – Độ đúng: khả năng tìm lại nằm trong khoảng 95 – 105%. Phương pháp quang phổ có nhiều ưu điểm: – Đơn giản. – Tiện lợi. – Cho kết quả nhanh chóng. – Chính xác. – Tiết kiệm chi phí. 6.2.KIẾN NGHỊ Dựa trên các kết quả đạt được chúng tôi có một số kiến nghị như sau: – Do quá trình làm, thiết bị có trục trặc nên cần tiếp tục khảo sát các khoảng thời gian giải phóng bao nhiêu phần trăm dược chất ở phép đo hòa tan. – Cần tiến hành định lượng ở những môi trường khác. – Cần tiến hành định lượng trên nhiều mẫu hơn nữa nhằm đạt độ chính xác cao hơn. – Ngày nay, với sự tiến bộ không ngừng của khoa học nên có nhiều phương pháp để thẩm định quy trình định lượng paracetamol như:  Phương pháp HPLC.  Phương pháp sắc ký khí. 40  Phương pháp cực phổ. Từ đó tăng tính chính xác hơn cho quá trình kiểm nghiệm dược phẩm, góp phần làm giảm sự lưu hành thuốc giả, thuốc kém chất lượng nhằm mang lại lợi ích cho người tiêu dùng. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt, Tiếng Anh 1. Bộ môn Bào chế – Trường Đại học Dược Hà Nội (2005). Một số chuyên đề về bào chế hiện đại. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Bộ Y tế (2007). Bào chế và sinh dược học tập 2. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. 3. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. 4. Bộ Y tế (2011). Kiểm nghiệm thuốc. Nhà Xuất Bản Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội. 5. Bộ Y tế (2012). Dược thư quốc gia Việt Nam. 6. Bộ Y tế (2013). Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc – phụ lục 8: Thẩm định phương pháp phân tích. 7. Dhopeshwarkar, V. and Zatz, J.L. (1993). “Evaluation of xanthan gum in the preparation of sustained release matrix tablets”. Drug Delivery, 19(9). p. 999- 1017. 8. Dipti Phadtare (2024). “Extend release formulation of BCS class i drugs”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4(04). p. 1676-1688. 9. Đặng Văn Giáp (2012). Phân tích dữ liệu trong kiểm nghiệm. Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí chúng tôi 51-56. 10. Hoàng Ngọc Hùng (2012). Tá dược và chất phụ gia dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội. 11. Lê Quan Nghiệm (2007). Sinh dược học và các hệ thống trị liệu mới. NXB Y học.tr. 50-60, 178-209. 12. Mohhamad Hosain, JamesWW. Ayres (1996). “Relative bioavailability of a novel sustained release acetaminophen mold tablets”. International Journal of Pharmaceutical, Volume 133, p. 223-235. 13. Nguyễn Lầu Hai (2014). Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV – Vis. Luận văn tốt nghiệp ngành Hóa học. Trường Đại Học Cần Thơ. 14. Nguyễn Thị Diệp Chi (2008). Bài giảng kiểm nghiệm thực phẩm và dược phẩm. Đại học Cần Thơ, Tp. Cần Thơ. 15. Robert B. Raffa (2005). Analgensis, Antipyretic and anti-inflamatory Drug, Remington: The science and practice in pharmacy, 21th edition. pp. 1541-1542. 16. The United States Pharmacopeial Convention (2013). The United States Pharmacopeia 36 – National Formulary 31. 17. Trần Thanh Đức (2012). Định lượng paracetamol trong một số dược phẩm trên địa bàn thành phố Cần Thơ bằng phương pháp UV – Vis. Luận văn tốt nghiệp Đại học. Trường Đại Học Cần Thơ. 18. Trần TửAn (2005). Kiểm nghiệm dược phẩm. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 42 19. Trần Tứ Hiếu (2008). Phân tích trắc quang phổ hấp thụ UV-Vis. Tái bản lần 2. Hà Nội. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 20. Trần Thị Thu Hằng (2014). Dược Lực Học. Nhà xuất bản Phương Đông.tr. 199- 200. 21. Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị Hồng Hảo và Nguyễn Thành Trung (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia Hà Nội. 22. Võ Thùy Ngân (2008). Nghiên cứu kỹ thuật và quy trình bào chế viên PTKD chứa diltiazem 90 mg. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học. Trường Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. Website 23.Andrew D. Trafford, Roger D. Jee và các cộng sự (1999). A rapid quantitative assay of intact paracetamol tablets by reflectance near-infrared spectroscopy. t. Access 15 May 2024. 24. Lê Nhất Tâm (2014). UV-Visiple Spectrophotometer. https://www.slideshare.net/nhattamnhattam/ph-uv-vis. Truy cập ngày 20.05.2024 25. Ramesh Sawant, Lokesh Bhangale và các cộng sự (2010). Validated spectrophotometric methods for simultaneous estimation of Paracetamol, Domperidone and Tramadol HCl in pure and tablet dosage form. origsite=gscholar&cbl=2042709. Access 15 May 2024 43 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thẩm định quy trình phân tích theo USP Loại quy trình phân tích Loại 1 Loại 2 Loại 3 Loại 4 Định lượng tạp Giới hạn tạp Độ đúng + + * * – Độ chính xác + + – – – Tính đặc hiệu + + + * + Giới hạn phát hiện – – + * – Giới hạn định lượng – + – * – Tính tuyến tính + + – * – Miền giá trị + + * * – *: có thể được thẩm định tùy thuộc vào yêu cầu của mỗi quy trình. Loại 1: định lượng nguyên liệu hay thành phẩm chính của thuốc. Loại 2: xác định tạp chất trong nguyên liệu hay sản phẩm phân hủy trong thuốc. Loại 3: định lượng hoạt chất phóng thích trong đo độ hòa tan. Loại 4: định tính. 44 Phụ lục 2: Độ hấp thụ của mẫu giả lập, giả dược ở bước sóng 257 nm khi khảo sát độ đặc hiệu 45 Phụ lục 3: Khảo sát tính tuyến tính ở bước sóng 257 nm 46 Phụ lục 4: Độ hấp thụ của mẫu khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm 47 Phụ lục 5: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 90% khi khảo sát độ đúng 48 Phụ lục 6: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 100% khi khảo sát độ đúng 49 Phụ lục 7: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 110% khi khảo sát độ đúng 50 Phụ lục 8: Độ hấp thụ của mẫu giả lập, giả dược ở bước sóng 257 nm khi khảo sát độ đặc hiệu trong đo độ hòa tan 51 Phụ lục 9: Khảo sát tính tuyến tính ở bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 52 Phụ lục 10: Độ hấp thụ của mẫu sau 15 phút khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 53 Phụ lục 11: Độ hấp thụ của mẫu sau 30 phút khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 54 Phụ lục 12: Độ hấp thụ của mẫu sau 1 giờ khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 55 Phụ lục 13: Độ hấp thụ của mẫu sau 2 giờ khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 56 Phụ lục 14: Độ hấp thụ của mẫu sau 3 giờ phút khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 57 Phụ lục 15: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 50% khi khảo sát độ đúng trong đo độ hòa tan 58 Phụ lục 16: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 80% khi khảo sát độ đúng trong đo độ hòa tan 59 Phụ lục 17: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 100% khi khảo sát độ đúng trong đo độ hòa tan 60 Phụ lục 18: Độ hấp thụ của mẫu Tylenol 650 mg Extended Release

Các file đính kèm theo tài liệu này:

doan_nguyen_ho_thien_nhi_491_2083105.pdf

Định Lượng Cu2+ Trong Mẫu Nước Bằng Phương Pháp Uv

                                                                               ThS. Lương Công Quang

                                                                  Khoa Công nghệ Hóa-Tài nguyên và Môi trường

Đặt vấn đề

Đồng (Cu) là khoáng chất được cơ thể hấp thụ ở dạ dày và phần trên của ruột non, sau đó đi vào máu. Đồng có tác dụngchống oxy hóa, ngừa ung thư, tốt cho tim mạch và rất cần thiết cho sự hoạt động của hệ thần kinh. Chất này có nhiều trong rau có màu xanh đậm, khoai tây, nấm, tôm, cua hay lúa mạch,…Đồng ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh hóa của cây như quá trình cố định N, sự khử nitrat, sự khử CO2, sự tổng hợp chloroplyll, tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng, sự thoát hơi nước, sự chuyển hóa gluxit, tạo các mô mới thân lá rễ, và ảnh hưởng đến tính chịu hạn, chịu lạnh, chịu nóng của cây.

Đồng là nguyên tố vi lượng giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển, ảnh hưởng đến sự tổng hợp nhiều loại chất đường, bột, hợp chất có đạm, chất béo, chloroplyll và các sắc tố khác, vitamin C và các enzim.

Đồng tồn tại trong nước dưới dạng ion Cu2+, hoặc dưới dạng phức xianua, tactrat…với hàm lượng không lớn dao động trong khoảng từ 0.001 đến 1mg/l. Để xác định hàm lượng đồng, người ta thường sử dụng phương pháp AAS, tuy nhiên ở một số phòng thí nghiệp chưa có máy AAS có thể dùng phương pháp trắc quang với thuốc thử dietyldithiocarbamate (DDC).

    Nguyên lý của phương pháp

    Phản ứng giữa Cu2+ với Pb-DDC xảy ra tại giá trị pH = 1.0 đến 1.5, trong trường hợp này ngoài đồng còn có Bi, Hg, Ag cùng tham gia phản ứng, các nguyên tố còn lại không tham gia phản ứng nên phương pháp này có độ chọn lọc cao vì Ag và Hg không gây cản trở do phức của chúng không màu.

    Loại bỏ các ảnh hưởng:

    – Bi: Nếu hàm lượng này vượt quá 30 µg/l thì cần phải lắc phức DDC kim loại với 25ml HCl 5M trong 5 phút, do đó phức Bi-DDC bị phân hủy còn phức Cu-DDC không bị phân hủy.

    – Phức Cu-xianua: thêm 0,5ml H2­SO4(1:1), 5ml HNO3 đặc vào 200 – 250ml mẫu chứa trong cốc chịu nhiệt, làm bay hơi dung dịch đến gần cạn khô (quá trình phân hủy nên đặt trong tủ hút). Để nguội, thêm vào 1ml HCl đặc và làm bay hơi đến khô, để nguội, thêm nước cất hai lần, đun nóng dung dịch đến sôi để hòa tan hết lượng muối rắn, lọc và chuyển toàn bộ dung dịch vào bình  mức thích hợp.

      Thiết bị và dụng cụ và hóa chất

      – Phểu chiết thể tích 250 ml hoặc 500ml; máy UV-VIS; các dụng cụ thông thường ở phòng hóa nghiệm;

      – H2SO4 1:1, HNO3 đậm đặc, HCl đậm đặc, dung môi hữu cơ toluene hoặc tương đương, Na-DDC, Pb-DDC trong toluene;

      Chuẩn bị một phểu chiết sạch thể tích 1000ml, thêm vào 50-100ml nước cất hai lần, 0.1 g Pb(NO3)2 loại tinh khiết phân tích, lắc kĩ để muối tan hết. Hòa tan 0.1 g Na-DDC trong lượng nước tối thiểu rồi thêm vào phểu chiết để kết tủa hết Pb-DDC, thêm vào phểu chiết 250ml toluene, đậy nút phểu chiết và lắc mạnh, toàn bộ kết tủa Pb-DDC sẽ tan hết vào trong toluene, tách bỏ tướng nước, phần tướng hữu cơ được lọc qua giấy lọc cho vào bình màu nâu, dung dịch bền trong ba tháng.

      – Dung dịch Cu2+ chuẩn nồng độ 1µg/ml.

        Trình tự phân tích

        – Lấy một thể tích nước cần phân tích sao cho chứa khoảng 0,2 – 0,6 µgCu/l, cho vào phễu chiết có thể tích 200-500ml, pha loãng mẫu nước nếu cần đến thể tích 100ml rồi thêm vào 5 giọt HCl(1:1), từ buret thêm vào một cách chính xác 10ml Pb-DDC trong toluene hoặc dung môi hữu cơ (có thể dùng petroleum thay thế). Cẩn thận đậy nút phểu chiết lại và lắc trong hai phút, giữ yên phễu chiết để cho hai tướng phân lớp, tách bỏ phần tướng nước phía dưới, phần tướng hữu cơ có chứa Cu-DDC có màu vàng được chuyển vào cuvet và tiến hành so màu tại bước sóng 430nm.

        – Lấy vào các phễu chiết: 0.2ml; 0.5ml; 1.0ml; 2.0ml; 3.0ml; 4.0ml; 5.0ml; 6.0ml dung dịch chuẩn Cu2+ có nồng độ 1µg Cu/ml, pha loãng bằng nước cất đến 100ml và tiến hành chiết tách như mẫu thử. Tiến hành với mẫu trắng song song.

          Tính kết quả

          Dùng phần mềm để xây dựng đường chuẩn. Nếu R2 <0,99 thì phải tiến hành lại thí nghiệm. Ngược lại tìm phương trình đường chuẩn y = a.x +b

          Từ phương trình đường chuẩn tính kết quả phân tích theo công thức sau:

          Trong đó: y là mật độ quang của mẫu phân tích

          a và b là các hằng số

          V1 là thể tích bình định mức (mL);

          V2 là thể tích mẫu (mL).

          TÀI LIỆU THAM KHẢO:

          [1]. Lê Đức, Giáo trình Một số phương pháp phân tích môi trường, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2024. [2]. TCVN 6193:1996 –ISO 8288: 1986(E). [3]. Võ Anh Khuê, Giáo trình các phương pháp phân tích hóa lý, trường Cao đẳng Công thương miền Trung, 2024.

          [1]. Lê Đức, Giáo trình Một số phương pháp phân tích môi trường, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2024. [2]. TCVN 6193:1996 –ISO 8288: 1986(E). [3]. Võ Anh Khuê, Giáo trình các phương pháp phân tích hóa lý, trường Cao đẳng Công thương miền Trung, 2024.

Máy Đo Quang Phổ Uv Vis

Hiệu suất quang học vượt trội của máy đo quang phổ UV Vis Excellence của METTLER TOLEDO tuân thủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của ngành dược phẩm; gi…

Hiệu suất quang học vượt trội của máy đo quang phổ UV Vis Excellence của METTLER TOLEDO tuân thủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của ngành dược phẩm; giao diện trực quan, các phương pháp được xác định trước và phép đo màu đều có trong một thiết bị nhỏ gọn, bền chắc. Sự kết hợp giữa công nghệ Array và nguồn sáng Xenon có tuổi thọ cao cho phép quét toàn bộ phổ chỉ trong vài giây và giảm đáng kể chi phí bảo trì. Tận hưởng hoạt động linh hoạt của một thiết bị độc lập, hoặc mở rộng không gian bàn làm việc của bạn với phần mềm máy tính LabX® để đảm bảo tính toàn vẹn dữ liệu, và kết nối các hệ thống đa thông số với các thiết bị khác của METTLER TOLEDO.

Máy đo quang phổ thể tích siêu nhỏ

UV5Nano là máy đo quang phổ thể tích siêu nhỏ chuyên dụng dùng để thực hiện các phép đo thể tích siêu nhỏ chính xác và có thể lặp lại chỉ với 1 µL mẫu. Công nghệ LockPath™ ngăn ngừa mẫu khô và cho phép đo phạm vi nồng độ rộng. Thiết bị nhỏ gọn và mạnh mẽ này tập trung vào các ứng dụng đo quang phổ khoa học sự sống, cung cấp cả phép đo cuvet và thể tích siêu nhỏ trên thiết bị độc lập, hoặc bằng phần mềm máy tính LabX®.

Phần mềm LabX® UV Vis

Phần mềm máy tính LabX® UV Vis bổ sung tính linh hoạt cho quy trình làm việc và hỗ trợ tuân thủ các quy định của FDA như 21 CFR Phần 11. Sự kết hợp của LabX® và máy đo quang phổ Excellence giúp hoàn toàn điều chỉnh các hệ thống tổng hợp UV Vis cho quy trình làm việc trong phòng thí nghiệm. Giải pháp phòng thí nghiệm thực hiện các phép tính, báo cáo và quản lý dữ liệu, tiết kiệm thời gian cho người vận hành cũng như quản lý phòng thí nghiệm, đồng thời loại bỏ nguy cơ xảy ra lỗi xử lý dữ liệu.

Các ứng dụng đo quang phổ UV Vis

Máy đo quang phổ UV Vis Excellence có thể được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp. Tuân thủ các quy định nghiêm ngặt trong ngành Dược phẩm và Mỹ phẩm với máy đo quang phổ UV7, mang lại hiệu suất quang học vượt trội và cùng với phần mềm máy tính LabX®, đảm bảo tính toàn vẹn dữ liệu và tuân thủ theo quy định. Các ngành Khoa học sự sống và Công nghệ sinh học có thể tăng hiệu suất từ các phương pháp được xác định trước của máy đo quang phổ UV5Bio và UV5Nano. Các ngành yêu cầu công suất cao có thể tự động hóa quy trình làm việc của họ và đo tới 303 mẫu với bộ lấy mẫu tự động InMotion.

Hãy truy cập Thư viện ứng dụng đo quang phổ UV Vis của chúng tôi và bổ sung kiến thức từ các ghi chú ứng dụng đã được kiểm chứng và kiểm tra kỹ lưỡng về phép đo quang phổ UV/VIS.

Các tài liệu, hội thảo trực tuyến, tài liệu kỹ thuật và video về phép đo quang phổ UV Vis đều có sẵn trong Thư viện chuyên môn của chúng tôi

Đồ Án So Sánh Hai Phương Pháp Định Lượng Berberin Nguyên Liệu Bằng Hplc Theo Dược Điển Trung Quốc (2005) Và Bằng Đo Quang Phổ Hấp Thụ Uv

Nhưvậy, nếu không yêu cầu độchính xác cao, có thểdùng phương pháp đo quang phổhấp thụUV-VIS theo DĐVN III để định lượng berberin nguyên liệu (đạt yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%) vì phương pháp này không tốn kém, tiến hành nhanh, thao tác đơn giản, dễthực hiện. Với thành phẩm do không quy định hàm lượng palmatin và những tạp khác cũng có thểhấp thụUV nên đểcó kết quả định lượng chính xác thì nên dùng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005).

* Tiến hành: 9 Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng berberin cĩ trong chế phẩm.  Phương pháp 3: [16] * Điều kiện sắc ký: – Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( 5 µm, 25 cm x 4,6 mm) – Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42). – Tốc độ dịng: 1ml/phút. – Detector UV ở bước sĩng 349 nm. * Tiến hành: Tương tự như 2 phương pháp HPLC đã trình bày ở trên. 1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC 1.3.1. Nguyên tắc Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hĩa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luơn tiếp xúc nhưng khơng hịa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung mơi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung mơi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. [8] 1.3.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với 10 một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung mơi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta cĩ sắc đồ. [8], [11] 1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký: Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phĩng đại và ghi thành sắc ký đồ( hình 1): Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng Trong đĩ : to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích. tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to. W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao Wb: Độ rộng đáy pic. 1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ [8] t t Wb2 0.5-2W 0.5-1W b1W R2 R2t’ t’R1 R1t o 1 t t t tt t ‘t ‘k 0 R 0 0R 0 R −= − == 11 Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2 – 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng cĩ giá trị khác nhau. 1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity – factor) α= tt tt ‘k ‘k 01R 02R 1 2 − − α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo cơng thức: =R ( ) ( )               α −α = + − = + − + ‘k1 ‘k ww tt ww tt B B A2/1B2/1 A,RB,R AB A,RB,R 1 4 N18,12 [4], [8] Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nĩ được tính theo cơng thức: a2 AF w 20/1= [4], [8] Trong đĩ: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ đường vuơng gĩc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tượng kéo đuơi càng rõ. Hiện tượng đỉnh kéo đuơi (tailing peak) cĩ thể là do tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trước (fronting peak) cĩ thể do lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột [7]. 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N Đặc trưng cho hiệu lực cột. 12 N = 16       w t B R 2 hay N=5,54       w t B2/1 R 2 [4], [8] Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng cơng thức: =H N L 1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau: a/Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi Bình chứa dung mơi thường bằng thủy tinh hoặc thép khơng gỉ. Dung mơi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và đuổi khí hịa tan. c/ Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột. Cĩ nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng cĩ thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp qua màng lọc 0,45 µm, cịn mẫu rắn cần hịa tan trong 1 dung mơi thích hợp. d/ Cột sắc ký lỏng HPLC Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hĩa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar. – Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh cĩ đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 µm). – Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm. 13 e/ Detector trong HPLC Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV – VIS. Ngồi ra cịn cĩ detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hĩa. f/ Thiết bị hiển thị kết quả Cĩ nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu đo dưới dạng pic. Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2 Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC 1.3.5. Cách đánh giá pic[7] * Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng lượng chất đĩ. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %). Phương pháp này cĩ thể dùng cho các pic khơng bị trơi đường nền và cả pic cĩ đường nền bị trơi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu Cột Binh chứa pha động Bơm Detector Bộ phận tự ghi Van tiêm mẫu 14 điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao. * Đánh giá chiều cao pic: Khi pic cĩ dạng khơng đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nĩ cũng cĩ thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k’ là hằng định. * Với pic cĩ đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic. 1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6] 1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc cĩ bước sĩng ở và cường độ Io qua dung dịch đồng nhất cĩ nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần cịn lại (I) thì đi qua dung dịch . Mối quan hệ giữa I và Io được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer. I = Io × 10 -ồCl Với ồ là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này khơng phụ thuộc vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sĩng của ánh sáng chiếu vào dung dịch. 1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer + Chùm tia sáng phải đơn sắc + Dung dịch phải lỗng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp) + Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang). + Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh sáng (UV-VIS). 1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer 15 + Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) như do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém. + Sai lệch do hố học: – Do sự phân ly (ion hố): thường gặp khi pha lỗng dung dịch, phân tử chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly khơng như nhau. – Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại cĩ độ hấp thụ khác dạng đơn phân tử. + Do phản ứng các chất lạ: – Chất lạ cĩ thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phịng hiện tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng cĩ thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần định lượng. – Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng cĩ thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng ″tạo màu″, phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng. 1.4.1.4. Một số đại lượng thơng dụng[ a/ Độ truyền qua (T-Transmittance): Độ truyền qua (hay cịn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa: T = 0 tI I = 10-ồCl Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất cĩ T=1(hay100%), nghĩa là hồn tồn khơng cĩ hấp thụ ánh sáng, người ta nĩi chất đĩ hồn tồn trong suốt. b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance): Độ hấp thụ (hay cịn gọi là mật độ quang) được định nghĩa : A = lg 1 T = ồ.C.l 16 Đối với một chất xác định (cĩ ồ xác định), thường đo trên một loại cốc đo (cĩ bề dày thơng thường là l=1 cm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch: A=K.C (K=ồ.l) c/ Hệ số hâp thụ phần trăm ( 11%cmE ): Theo cơng thức A =ồ.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì : A = ồ = 11% cmE Vậy 11% cmE chính là độ hấp thụ của dung dịch cĩ nồng độ 1%, dùng cốc đo cĩ bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một ở xác định, 11% cmE là một hằng số. d/ Hệ số hấp thụ phân tử (ồỡ): Hệ số hấp thụ phân tử, hay cịn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung dịch cĩ nồng độ 1M/l, dùng cốc đo cĩ bề dày1cm. Cũng như 11% cmE , với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định (ở, dung mơi, nhiệt độ,…) ồỡ là một hằng số. Giữa 11% cmE và ồỡ cĩ mối liên hệ ồỡ = 1 1% 10 cmE × M ở đây M là phân tử gam của chất tan. 1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV- VIS.[2],[4],[8] 1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá trị 11% cmE biết trước (tra cứu). A = 11% cmE .C.l → C = 1 1% cm A E (với l =1 cm) 17 Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sĩng (ở) và mật độ quang A bằng cách:  Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng cĩ bước sĩng xác định).  Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.  Dùng một kính lọc Holmium (cĩ các giá trị ởmax xác định cho trong tài liệu )để kiểm tra lại máy.  Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành dung dịch cĩ nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị ởmax và tìm Amax . 1.4.2.2. Phương pháp so sánh Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử cĩ nồng độ Cx (chưa biết) và của dung dịch chuẩn cĩ nồng độ Ac (đã biết). Ta cĩ: x c A A = xC cC → Cx = x c A A x Cc Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc khơng được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả càng chính xác. Ngồi ra cịn cĩ các kỹ thuật định lượng khác như: phương pháp đường chuẩn, phương pháp thêm đường chuẩn, phương pháp chuẩn độ đo quang, phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ . 18 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử: 2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: . Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp . Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ mơn Hố Dược cung cấp . Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp 2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử: . Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4) . Heptane sodium sulfonate, triethylamine . Acetonitril dùng cho HPLC (Merk) . Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ mơn Hĩa vơ cơ trường đại học Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC . Một vài hĩa chất khác 2.1.1.3. Thiết bị: + Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode array- PDA 100 + Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg + Máy đo pH JENWAY của Anh + Máy cất nước 2 lần + Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức 19 + Máy lọc hút chân khơng Satorius + Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml … + Cốc cĩ mỏ: các loại 100; 200; 500 + Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh. + Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm… 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: . Phân tích mẫu thử bằng phương pháp HPLC và phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV- VIS . Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của hai phương pháp trên . So sánh 2 phương pháp trên 2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:  Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn phương pháp phân tích  Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu được, xử lý thống kê và rút ra kết luận  Phương pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: . Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê – sử dụng cơng cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel . Một số đặc trưng thống kê được sử dụng: – Giá trị trung bình: ∑ = = n 1i ixn 1 x – Độ lệch chuẩn: ( ) 1n x S n 1i 2 ix − − = ∑ = 20 – Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% = S x × 100 – Sai số chuẩn : n S sx = – Sai số tương đối: ( ) 100 x % st x)1n( ××=ε −α – Khoảng tin cậy: µ = x ± tαSx Trong đĩ : xi là kết quả xác định lần thứ i ; n là số lần xác định + Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2 phương pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn = 2 1 2 2 S S nghĩa thống kê nhau cĩ ý nghĩa thống kê  Ftn<Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê  Flt tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1 + Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau : T = 1 2 1 2 1 1p n n X X S + − ( ) ( )2 21 1 2 2 1 2 1 1 2 n S n S n n − + − + − 21  T < 1 2 2/2n ntα + − : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê + − : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau cĩ ý nghĩa thống kê  1 2 2/2 n ntα + − tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n1+n2-2 2.2. Kết quả thực nghiệm : 2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III * Cách tiến hành : + Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hồ tan trong 200 ml nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml. Lấy 10 ml dung dịch này pha lỗng với nước đến 100 ml (C = 20 µ g/ml) + Dung dịch chuẩn được pha tương tự dung dịch thử , dùng chất đối chiếu berberin clorid + Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện tại bước sĩng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc đo dày 1 cm. * Cách tính kết quả : * Do cĩ sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên chúng tơi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn. 22 Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính theo cơng thức : C% = t c c t mA mA × × × C Trong đĩ : C% : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu thử. C : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu chuẩn At : Độ hấp thụ của dung dịch thử. Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. mt : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử. mc : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn. Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 . Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu STT Khối lượng cân(g) Độ hấp thụ(A) C% 1 0,1971 0,269 86,50 2 0,2010 0,272 85,76 3 0,2062 0,280 86,06 4 0,2090 0,285 86,42 5 0,2030 0,277 86,48 Chuẩn 0,2001 0,263 83,30 23 Theo kết quả ở bảng 1, ta cĩ:  Giá trị trung bình: X = 86,24%  Độ lệch chuẩn : S = 0,324  Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): ∆X(%) = 0,40  Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,37% Kết luận: Hàm lượng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24% ± 0,40%. 2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III 2.2.2.1./Tính chính xác : Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song. Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.1.1 Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Như vậy phương pháp là chính xác 2.2.2.2 Tính tuyến tính: Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ trên chất chuẩn Berberin. Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid cĩ khối lượng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lượng) Cách tiến hành tương tự 2.2.1 Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch 24 STT 1 2 3 4 5 C (mg/ml) 0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240 A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315 Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch – Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013; – Hệ số tương quan: 0,998 – Độ lệch chuẩn của y_ intercept: Sb = 0,009 – Với độ tin cậy 95% ta cĩ khoảng tin cậy của y_intercept: b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay – 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042 Từ kết quả trên cho thấy hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99…Tất cả các giá trị nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc. y = 12.5x + 0.013 R = 0.998 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 § é h Êp t h ơ A C(mg/ml) 25 2.2.2.3. Độ đúng: . Cân 3 mẫu chất đối chiếu Beberin clorid ( hàm lượng 83,3%) với khối lượng từ 0,1600g → 0,2400g (tại các điểm 80, 100, 120% so với lượng cân dùng khi định lượng) . Tiến hành tương tự 2.2.1. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình . Tính tốn kết quả khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu chuẩn là 0,263 ứng với khối lượng cân 0,2001g Kết quả thu được ghi ở bảng 3 Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS STT Khối lượng cân (g) Lượng hoạt chất cĩ thực a (g) Độ hấp thụ trung bình (A) Lượng tìm lại trung bình b (g) Phần trăm tìm lại (b/a.100%) 1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88 2 0,2024 0,1683 0,267 0,1696 100,77 3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86 Từ kết quả bảng 3 ta cĩ: – Trung bình % tìm lại: 100,17% – Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x – 0,008 – Hệ số tương quan: r = 0,999 26 – Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003 – Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,019 – Với độ tin cậy 95% ta cĩ: Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992 < a < 1,112 Khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = – 0,008 ± 0,009 hay – 0,017 < y_intercept < 0,001 Hình 7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng hoạt chất tìm lại và lượng hoạt chất cĩ thực Kết luận: – Khơng cĩ sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. – Khơng cĩ sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1. – Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong khoảng từ 98% đến 102%. Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát. 2.2.2.4. Tính đặc hiệu: Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm khơng cĩ chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tơi chỉ tiến hành xác định sự ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng y = 1.052x – 0.008 R = 0.999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 L ỵ n g t ×m l ¹i ( g ) Lỵng ho¹t chÊt cã thùc (g) 27 Tiến hành: + Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hịa tan trong 200 ml nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu được dunhg dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào 4 bình định mức 100 ml. + Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so với nồng độ của berberin clorid đem đo . Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hịa tan trong 20 ml nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dung dịch palmatin chuẩn 0,02 mg/ml . Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, ta được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml. . Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml. . Lần lượt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vào 3 bình định mức 100 ml đã chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nước vừa đủ tới vạch. Một bình định mức 100 ml khơng thêm palmatin và thêm nước tới vạch. Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bước sĩng 421 nm Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới độ hấp thụ quang của berberin clorid Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Berberin clorid 0,2 mg/ml (ml) 10 10 10 10 Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10 28 Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10 Độ hấp thụ A 0,263 0,282 0,271 0.266 Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5% palmatin, hàm lượng berberin trong bột nguyên liệu định lượng theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu cĩ 2% palmatin như trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả định lượng tăng 0,91% Vậy phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu. 2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): Điều kiện sắc ký để định lượng Berberin clorid nguyên liệu – Cột sắc ký: hạt nhồi silicagel được octadecylsilan hĩa – Detector UV: 263 nm – Pha động: đệm phosphate [ hỗn hợp KH2PO4 0,05M và heptan Na sulfonate(1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh pH=3,0 bằng H3PO4] – acetonitril (60:40). – Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng thí nghiệm – Thể tích tiêm: 20ỡl – Tốc độ dịng: 1,5 ml/phút * Tiến hành: + Dung dịch thử: Cân 0,04 g berberin clorid hịa tan trong nước nĩng, cho vào bình định mức 100 chúng tôi đĩ làm lạnh và thêm nước tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào bình định mức 25 ml , thêm nước tới vạch. 29 + Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid + Tiêm lần lượt 10 ỡl dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, chạy sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn. Dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic trên sắc đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, nồng độ của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) Berberin clorid cĩ trong mẫu thử theo cơng thức sau: HL% = 83,30t c c t S m S m × × × Trong đĩ: tS : Diện tích pic mẫu thử cS : Diện tích pic mẫu chuẩn ( cS = 12,2646) cm : Khối lượng cân mẫu chuẩn (0,0405 g) X : Khối lượng cân mẫu thử 83,30: Hàm lượng thực của mẫu chuẩn Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu STT Khối lượng cân (g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) 1 0,0407 12,6917 85,78 2 0,0402 12,6120 86,30 3 0,0398 12,4224 85,86 4 0,0405 12,7101 86,32 5 0,0400 12,5350 86,20 Chuẩn 0,0405 12,2646 83.30 Theo kết quả ở bảng 5, ta cĩ: 30 – Giá trị trung bình: X = 86,09 % – Độ lệch chuẩn: S = 0,254 – Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): X (%) = 86,09% ± 0,315% – Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 0,295 Vậy theo phương pháp định lượng trên, hàm lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu là: 86,09% ± 0,315% 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): 2.2.4.1. Tính chính xác: Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.3 Kết quả thử độ chính xác cho thấy độ lệch chuẩn của các kết quả RSD =0,295 % < 2%. Vậy phương pháp là chính xác. 2.2.4.2. Tính tuyến tính: Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic trên chất chuẩn Berberin. Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid cĩ khối lượng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lượng) Tiến hành tương tự 2.2.3 Kết quả thu được ở bảng 6 Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch STT 1 2 3 4 5 C (ỡg/ml) 25,76 28,80 32,16 35,04 38,48 Diện tích pic (mAU.min) 9,7115 10,8580 12,1243 13,2081 14,5069 31 Hình 10: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ của dung dịch – Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch là:y = 0,377x + 0,002 – Hệ số tương quan: R = 0,9999 – Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003 – Với độ tin cậy 95% ta cĩ khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = 0,002 ± 0,009 hay – 0,007 < y_intercept <0,011 Nhận xét: Hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99…Tất cả các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. Vậy phương pháp này là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc. 2.2.4.3. Tính đúng: . Cân 3 mẫu chất đối chiếu berberin clorid (hàm lượng 83,3%) với khối lượng từ 0,032g → 0,048g (tại các điểm 80%,100%,120% so với lượng cân dùng khi định lượng). . Mỗi mẫu chạy sắc ký 3 lần, lấy giá trị trung bình. Tiến hành tương tự 2.2.3 y = 0.377x + 0.002 R = 0,999 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 D iƯ n t Ýc h p ic ( m A U .m in ) C(µg/ml) 32 . Tính tốn kết quả khảo sát tính đúng dựa trên diện tích pic của mẫu chuẩn là 12,2646 chúng tôi ứng với khối lượng cân 0,0405 g. Két quả thu được ghi ở bảng 7 Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC STT Khối lượng cân(g) Lượng Beberin clorid cĩ thực a (g) Diện tích pic trung bình (mAU.min) Lượng tìm lại trung bình b (g) Phần trăm tìm lại %=b/a× 100% 1 0,0322 0,0268 9,8535 0,0270 100,75 2 0,0402 0,0335 12,1701 0,0334 99,70 3 0,0481 0,0401 14,5705 0,0400 99,75 Hình 11: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng hoạt chất cĩ thực và lượng tìm lại – Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 0,997x + 0,001 – Hệ số tương quan: R = 0,999 – Trung bình % tìm lại :100,07% – Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,001 – Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,013 y = 0.977x + 0.001 R = 0.999 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 L ỵ n g t ×m l ¹i ( g ) Lỵng ho¹t chÊt cã thùc (g) 33 – Với độ tin cậy 95% ta cĩ: Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa hay 0,9560 < a <1,038 Khoảng tin cậy của y_intercept :b ± 3,182Sb hay -0,002 < y_intercept <0,004 Kết luận : – Khơng cĩ sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. – Khơng cĩ sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1. – Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,07% nằm trong khoảng từ 98% đến 102%. Như vậy phương pháp là đúng trong khoảng khảo sát. 2.2.4.4. Tính đặc hiệu: Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm khơng cĩ chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tơi chỉ tiến hành xác định sự ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng Tiến hành: . Cân 0,04 g berberin clorid chuẩn hịa tan trong nước nĩng, cho vào bình định mức 100 chúng tôi đĩ làm lạnh và thêm nước tới vạch, thu được dung dịch Berberin clorid 0,4 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào 4 bình định mức 25 ml , thêm nước tới vạch. . Pha dung dịch palmatin chuẩn cĩ nồng độ 10%; 5%; 2,5% so với nồng độ berberin clorid đem chạy sắc ký. + Cân 0,04 g palmatin chuẩn hịa tan trong nước nĩng, cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml 34 dịch lọc đầu. Lấy 5 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước tới vạch, thu được dung dịch palmatin 0,04mg/ml. + Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,04 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước tới vạch., thu được dung dịch palmatin 0,02 mg/ml. + Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước tới vạch, thu được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml. . Lần lượt thêm 2 ml dung dịch palmatin 0,04; 0,02; 0,01 mg/ml vào 3 bình định mức 25 ml trên, thêm nước vừa đủ tới vạch. Bình định mức 25ml khơng thêm palmatin được thêm nước vừa đủ tới vạch. . Chạy sắc ký dung dịch 4 bình này. Kết quả thu được ghi trong bảng 8 Bảng 8: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới diện tích pic của Berberin clorid Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Berberin clorid 0,4 mg/ml 2 2 2 2 Palmatin 0,04 mg/ml 2 Palmatin 0,02 mg/ml 2 Palmatin 0,01 mg/ml 2 Diện tích pic (mAU.min) 12,2650 12,3011 12,3229 12,2530 35 Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn cĩ thêm Palmatin Nhận xét: Diện tích pic hầu như khơng thay đổi khi cĩ mặt tới 10% palmatin. Vậy phương pháp cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt của tạp chất này. 2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III: 2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng: 0.7 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 13.4 -5.0 35.0 KLLien #83 [modified by Adminis trator] BERBERIN T H10,4 UV_VIS_1 mAU min 1 – 4.653 2 – 7.420 WVL:263 nmAz 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 -0.10 1.0 ] UV_VIS_1 mAU min WVL:263 nm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 -5.0 35.0 BERBERIN CH UV_VIS_1 mAU min 1 – 7.353 WVL:263 nm 36 Các tính tốn được thực hiện trên các kết quả thu được khi định lượng Berberin clorid nguyên liệu do bộ mơn Hĩa Dược trường Đại Học Dược Hà Nội cung cấp. Tĩm tắt kết quả thu được khi định lượng nguyên liệu Berberin clorid bằng hai phương pháp ở bảng 9 Bảng 9: Tĩm tắt các kết quả thực nghiệm thu được khi định lượng nguyên liệu Berberin clorid Phương pháp Hàm lượng trung bình (%) Phương sai (S2) Độ lêch chuẩn (S) Số lần thí nghiệm HPLC 86,09 0,0645 0,254 5 Đo quang UV-VIS 86,24 0,1050 0,324 5 Ftn = 0,1050/0,0645 = 1,3 S1: độ lệch chuẩn của phương pháp đo quang UV-VIS S2: độ lệch chuẩn của phương pháp HPLC Flt ( ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K1 = 5 – 1 = 4; K2 = 5 – 1 = 4) là: 6,39 Như vậy Ftn<Flt do đĩ độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê. 2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định lượng : Do độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê nên để so sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định lượng, ta dùng Test T. 37 T = 1 2 1 2 1 1p n n X X S + − với pS = ( ) ( )2 21 1 2 2 1 2 1 1 2 n S n S n n − + − + − T phân phối Student với n1 + n2 – 2 bậc tự do ở mức tin cậy 95% hay ỏ =0,05, ta cĩ: ( )1 2 2 8/2 0,025n nt tα + − = =2,306 pS = 4.0,0645 4.0,1050 5 5 2 + + − = 0,291 Do đĩ Tqs = 86,24 86,09 1 10,291 5 5 − + = 0,815 Như vậy 0,815 < 2,306 nên với mức ý nghĩa 0,05 giá trị trung bình hàm lượng Berberin trong nguyên liệu của hai phương pháp định lượng khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê. 2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III  Phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): + Ưu điểm: . Phương pháp cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất palmatin + Nhược điểm: . Yêu cầu phải cĩ các hĩa chất dung mơi tinh khiết dùng cho HPLC . Chi phí cao khi phải chạy pha động cĩ acetonitril và đặc biệt là hĩa chất heptan natri sulfonat rất đắt tiền . Quá trình chuẩn bị chạy sắc ký và chạy đường nền tốn thời gian  Phương pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III: + Ưu điểm: . Khơng tốn hĩa chất dung mơi 38 . Thời gian phân tích nhanh chĩng, chỉ cần 5-10 phút cĩ thể cho biết ngay kết quả . Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ + Nhược điểm: Phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu (palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng) 2.3. BÀN LUẬN: Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, đang từng bước được đưa vào phịng kiểm nghiệm và trung tâm kiểm nghiệm ở Việt Nam. Phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) cho biết hàm lượng Berberin trong nguyên liệu là 86,09% ± 0,315%; phương pháp chính xác với RSD = 0,295% < 2%, tuyến tính trong khoảng 80%-120% nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo sát. Ưu điểm của phương pháp này là cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất palmatin trong nguyên liệu Berberin. Tuy nhiên phương pháp này lại rất tốn kém khi phải dùng những dung mơi và hĩa chất đắt tiền như: natri heptan sulfonat, acetonitril… Hàm lượng Berberin trong nguyên liệu khi định lượng bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III là 86,24% ± 0,40%; phương pháp chính xác với RSD = 0,37% < 2%, tuyến tính trong khoảng 80%-120% nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo sát nhưng khơng đặc hiệu ( tạp chất palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng). Tuy nhiên. DĐVN III cĩ quy định giới hạn tạp chất palmatin khơng quá 2% [6]. Theo kết quả ở mục 2.2.2.4 thì nếu palmatin cĩ mặt 2%, kết quả định lượng tăng 0,91%. Nên với berberin nguyên liệu thõa mãn yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin thì sự cĩ mặt của palmatin khơng ảnh hưởng lớn đến kết quả định lượng. 39 Ngồi ra, khi so sánh kết quả của hai phương pháp định lượng ta thấy độ chính xác và giá trị trung bình khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Như vậy, nếu khơng yêu cầu độ chính xác cao, cĩ thể dùng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III để định lượng berberin nguyên liệu (đạt yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin khơng quá 2%) vì phương pháp này khơng tốn kém, tiến hành nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện. Với thành phẩm do khơng quy định hàm lượng palmatin và những tạp khác cũng cĩ thể hấp thụ UV nên để cĩ kết quả định lượng chính xác thì nên dùng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005). KẾT LUẬN * Kết luận Trong quá trình thực hiện khĩa luận tốt nghiệp, chúng tơi đã thu được một số kết quả: + Xác định được hàm lượng của berberin trong nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS ( theo DĐVN III) và bằng phương pháp HPLC( theo dược điển Trung Quốc 2005). Kết quả cho thấy cả hai phương pháp đều đáp ứng các chỉ tiêu : độ chính xác, độ đúng, tính tuyến tính. Nhưng chúng khác nhau về tính đặc hiệu: phương pháp HPLC với sự cĩ mặt palmatin khơng ảnh hưởng tới kết quả định lượng, trong khi đĩ palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng trong phương pháp đo quang phổ UV-VIS + Hiểu được cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, một phương pháp phân tích hiện đại cĩ nhiều ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc, biết sử dụng thành thạo các thao tác cơ bản của máy HPLC. + Học được cách tìm tài liệu, làm thực nghiệm và trình bày văn bản một cách khoa học về một vấn đề nghiên cứu; 40 + Tìm hiểu phương pháp HPLC, làm quen và sử dụng thành thạo được máy HPLC để định lượng một sản phẩm; biết cách đánh giá một phương pháp định lượng. * Đề xuất: Do điều kiện thời gian và hĩa chất cĩ hạn nên chúng tơi chỉ mới tiến hành định lượng Berberin clorid nguyên liệu. Tuy nhiên từ kết quả thu được trong khĩa luận, chúng tơi cĩ những đề xuất sau: + Áp dụng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc(2005) để định lượng Berberin clorid trong một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt + Nghiên cứu, khảo sát điều kiện định lượng berberin bằng HPLC khơng phải dùng Natri heptan sulfonat để áp dụng định lượng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong nước. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng việt 1. Bộ mơn Dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội, tập 2, tr. 89- 91. 2. Bộ mơn Hĩa Phân tích (2006), Hĩa phân tích, Trường ĐH Dược Hà Nội, tập 2, tr. 41- 62. 3. Bộ mơn Hĩa Phân tích (2002), Hĩa phân tích, Trường ĐH Dược Hà Nội, tập 1, tr. 27- 44. 4. Bộ mơn Hĩa Phân tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường ĐH Dược Hà Nội, tr. 68- 79,83-98. 5. Bộ Y tế (1994), Dược điển Việt Nam II, Nhà xuất bản Y học, tập 3, tr.71- 74. 6. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr.33- 35, 178- 179 phụ lục 3 (PL- 75, 76). 7. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản y học thành phố Hồ Chí Minh, tr.138,148-149. 8. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (1998), Hĩa phân tích tập 2, Đại học dựợc Hà Nội, tr.55-98. 9. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Xuất bản lần thứ VIII- Nhà xuất bản Y học, tr.195. 10. Từ Văn Mạc (1995), Phân tích hĩa lý, NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr.313-319. 11. DS. Phạm Thiệp- DS.Vũ Ngọc Thúy( tái bản lần thứ 13), Thuốc biệt dược và cách sử dụng, Nhà xuất bản Y học, tr.106. II. Tiếng Anh 12. Martindal 34 (2005), volume II, p.1659. 42 13. Pharmacopoeia of the people′s republic of China (2005), volum III, p.94- 96. 14. The Korean Pharmacopoeia, 8th edition (2002), p.81-82. 15. The Japanese Pharmacopoeia fifteenth edition (2006), p.351- 352. 16. Wang, S. D; Song, B.S . (2000), Determination of berberin in decoted liquid from Shensu granules with water by reversed- phase liquid chromatography, Sepu, p. 261- 262. III. Trang web 17. Cây thuốc quý (2007), berberin, www. cây thuốc quý. chúng tôi 18. Wikipedia (2007), berberin, . 43 ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………….. 2 PHẦN I. TỔNG QUAN …………………………………………………………………….. 3 1.1. VÀI NÉT VỀ BERBERIN: ………………………………………………………. 3 1.1.1. Cấu trúc: ………………………………………………………………………………… 3 Cấu trúc của isoquinolin ……………………………………………………………………. 3 Cơng thức cấu tạo: …………………………………………………………………………… 3 1.1.2. Nguồn gốc: ………………………………………………………………………………. 3 1.1.3. Tính chất ………………………………………………………………………………… 4 1.5. Tác dụng dược lý: ………………………………………………………………………. 4 1.1.6. Chống chỉ định: [17] ………………………………………………………………… 5 1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: [11] …………………………………………………. 5 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN: ……………… 5 1.2.1. Phương pháp thể tích: [5], [13] …………………………………………………. 5 1.2.2. Phương pháp đo UV-VIS …………………………………………………………. 5 1.2.3. Phương pháp cân [5] ……………………………………………………………….. 6 1.2.4. Phương pháp HPLC ………………………………………………………………… 7 1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC ……………………………………….. 9 1.3.1. Nguyên tắc ………………………………………………………………………………. 9 1.3.2. Cơ sở lý thuyết ………………………………………………………………………… 9 1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký: …………………………… 10 Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng ………………………. 10 1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ ………………………………………………………………. 10 1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity – factor) …………………………………………… 11 α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. …… 11 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) ………………………………………………………. 11 =R ( ) ( )               α −α = + − = + − + ‘k1 ‘k ww tt ww tt B B A2/1B2/1 A,RB,R AB A,RB,R 1 4 N18,12 [4], [8] …………………. 11 Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 ……………………………………………. 11 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF …………………………………………………………………… 11 Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nĩ được tính theo cơng thức: ……… 11 Trong đĩ:………………………………………………………………………………………… 11 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N ………………………………………………………………….. 11 N = 16       w t B R 2 hay N=5,54       w t B2/1 R 2 [4], [8] ……………………………… 12 1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] ………………………………. 12 a/Hệ thống bơm ………………………………………………………………………………. 12 a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi …………………………….. 12 c/ Hệ tiêm mẫu ……………………………………………………………………………….. 12 44 d/ Cột sắc ký lỏng HPLC ………………………………………………………………….. 12 e/ Detector trong HPLC ……………………………………………………………………. 13 Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC ……………………………………. 13 1.3.5. Cách đánh giá pic[7] ………………………………………………………………. 13 1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 14 1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6] ……………………………………………………. 14 1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer ……………………………………………………….. 14 1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer …………………………. 14 1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer ………………………………… 14 1.4.1.4. Một số đại lượng thơng dụng[ ……………………………………………….. 15 1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV- VIS.[2],[4],[8] …………………………………………………………………………………. 16 1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: ………………………………………………. 16 1.4.2.2. Phương pháp so sánh …………………………………………………………… 17 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ………………………………………. 18 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu ……………………………… 18 2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử: ……………………………………………. 18 2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: …………………………………………………………. 18 2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử: ……………………………………………………………. 18 2.1.1.3. Thiết bị: ……………………………………………………………………………… 18 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: ………………………………………………………. 19 2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: ……………………………………………………………. 19 2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: ……………………… 19 2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: ……………………………………… 19 2.2. Kết quả thực nghiệm : ………………………………………………………………. 21 2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ……………………………………. 21 Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu……………. 22 2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ……. 23 2.2.2.1./Tính chính xác : ………………………………………………………………….. 23 Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song. ……………………………………….. 23 2.2.2.2 Tính tuyến tính: ……………………………………………………………………. 23 Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch ………… 23 Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào ………………. 24 2.2.2.3. Độ đúng: …………………………………………………………………………….. 25 2.2.2.4. Tính đặc hiệu:……………………………………………………………………… 26 Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới … 27 45 2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): ………………………………………………………………………… 28 HL% = 83,30t c c t S m S m × × × ………………………………………………………………………. 29 Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu …………………… 29 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): ………………………………. 30 2.2.4.1. Tính chính xác: …………………………………………………………………… 30 2.2.4.2. Tính tuyến tính: …………………………………………………………………… 30 Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch ………….. 30 2.2.4.3. Tính đúng: ………………………………………………………………………….. 31 Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC ……………. 32 2.2.4.4. Tính đặc hiệu:……………………………………………………………………… 33 Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng ………………………………………………………….. 35 Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn …………………………………………………………. 35 Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn cĩ thêm Palmatin ……………………………….. 35 2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III: …………………………… 35 2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng: 35 2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định lượng : …………………………………………………………………………………………… 36 2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ….. 37 . Khơng tốn hĩa chất dung mơi …………………………………………………………… 37 . Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ ………………………….. 38 2.3. BÀN LUẬN: …………………………………………………………………………….. 38 KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………. 39 * Kết luận ………………………………………………………………………………………. 39 * Đề xuất: ………………………………………………………………………………………. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………………………. 41 I. Tiếng việt ……………………………………………………………………………………. 41 II. Tiếng Anh …………………………………………………………………………………. 41 III. Trang web ……………………………………………………………………………….. 42

Các file đính kèm theo tài liệu này:

_t_v_n__1522.pdf

Phương Pháp Nghiên Cứu Định Lượng

Published on

Giới thiệu phương pháp nghiên cứu định lượng sử dụng SPSS, EViews

1. Trung tâm Nghiên Cứu Định Lượng Hà Nội Website: chúng tôi LOGO NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TRONG KINH DOANH Đào Trung Kiên chúng tôi Nghiencuudinhluong.com

2. NỘI DUNG ● Nghiên cứu khoa học trong kinh doanh ● Phân loại nghiên cứu ● Nghiên cứu định lượng ● …………….. Nghiencuudinhluong.com

3. Nghiên cứu khoa học trong kinh doanh ● Nghiên cứu khoa học là cách thức con người tìm hiểu các hiện tượng khoa học một cách có hệ thống (Babbie, 1986, dẫn theo Thọ, 2011) ● Nghiên cứu khoa học trong kinh doanh là cách thức khám phá các hiện tượng trong kinh doanh một cách có hệ thống. ● Ví dụ: Xem xét ảnh hưởng của tỷ giá đến lạm phát, ảnh hưởng của chất lượng dịch vụ đến sự hài lòng khách hàng… Nghiencuudinhluong.com

4. Nghiên cứu khoa học trong kinh doanh Có hai cách để đạt sự hiểu biết + Chấp nhận: thừa nhận từ nghiên cứu hay kinh nghiệm từ người khác. Ví dụ: KN nói chuyện với KH, bạn gái…. + Nghiên cứu (mang tính khám phá): Tìm kiếm sự hiểu biết qua nghiên cứu và trải nghiệm của chính mình. Nghiencuudinhluong.com

6. Nghiên cứu định lượng là gì ? ● Nghiên cứu định lượng dựa vào việc đo lường số lượng. Nghiên cứu định lượng được áp dụng đối với các hiện tượng có thể được diễn tả bằng số lượng (Kothari, 2004) ● Nghiên cứu định lượng thường gắn với việc kiểm định (lý thuyết) dựa vào quy trình suy diễn (Thọ, 2011) Nghiencuudinhluong.com

7. Nghiên cứu định lượng là gì ? Như vậy: ● Nghiên cứu định lượng là nghiên cứu sử dụng các phương pháp khác nhau (chủ yếu là thống kê) để lượng hóa, đo lường, phản ánh và diễn giải các mối quan hệ giữa các nhân tố (các biến) với nhau. ● Ví du: Đo lường mức độ hài lòng KH đối với chất lượng dịch vụ, đo lường mức độ trung thành của người LĐ, vv. Nghiencuudinhluong.com

8. Mục đích của nghiên cứu định lượng ● Đo lường mức độ của các mối quan hệ. Ví dụ: Mối quan hệ giữa giá cá và giá thịt gà (co dãn trong vi mô) ● Kiểm định các giả thuyết nghiên cứu có được từ lý thuyết. ● Ví dụ: Kiểm định giả thuyết cho rằng tăng lương thì người lao động hài lòng hơn là giảm lương. Nghiencuudinhluong.com

9. Ứng dụng nghiên cứu định lượng Nghiên cứu định lượng có rất nhiều ứng dụng trong kinh tế, kinh doanh ● Nghiên cứu hài lòng khách hàng (SERVQUAL Model, CSI Model) ● Đánh giá lao động trong tổ chức (JDI Model, Minnesota, …) ● Đánh giá chấp nhận công nghệ, dịch vụ mới (TAM model, ISS, E -CAM) Nghiencuudinhluong.com

10. Ứng dụng nghiên cứu định lượng ● Đánh giá hành vi khách hàng (TRA, TPB Model) ● Đánh giá thu hút đầu tư vào địa phương (sử dụng các thuộc tính của marketing địa phương). ● …… Và rất nhiều thứ khác, tùy mục đích nhà nghiên cứu. ● Ví dụ gần gũi: Làm luận văn thạc sỹ, luận án tiến sỹ Nghiencuudinhluong.com

11. Tại sao NCĐL lại trở lên phổ biến? ● Do sự nghi ngờ kết quả các phương pháp định tính “Gần đây, kết quả nghiên cứu của các phương pháp định tính không mấy khả quan. ……Dữ liệu thu thập được bởi các nhà nghiên cứu thị trường ngày càng bị khách hàng của họ đặt vấn đề” (Rossi, Vriens). ● Do sự phát triển của các phương pháp thống kê và hỗ trợ của các phần mềm máy tính (SPSS, EVIEWS, SAS, AMOS, STATA,..) Nghiencuudinhluong.com

12. Tại sao NCĐL lại trở lên phổ biến? ● Đặc biệt là tính tin cậy của các nghiên cứu định lượng. Nghiencuudinhluong.com

13. Xu hướng sử dụng các NCĐL ● Hầu hết các bài đăng trên tạp trí quốc tế trong lĩnh vực kinh tế hiện nay sử dụng phương pháp định lượng. ● Các chương trình thạc sỹ, nghiên cứu sinh của các ĐH lớn phần lớn sử dụng nghiên cứu định lượng (Các nghiên cứu định tính cũng không giống các chương trình kiểu “3 chương” của Việt Nam) Nghiencuudinhluong.com

14. Xu hướng sử dụng các NCĐL Tại Việt Nam: ● ĐH Kinh tế HCM: có định hướng áp dụng sử dụng nghiên cứu định lượng cho học viên cao học từ K16, ĐH Kinh tế Đà Nẵng ● Thông tin: nghiên cứu sinh ĐH KTQD nhiều ngành phải sử dụng nghiên cứu định lượng ● Một số chương trình cao học liên kết bắt buộc phải sử dụng định lượng: ĐH Shute (Đài Loan), Nantes (Pháp), vv. Nghiencuudinhluong.com

15. Thế nào là một nghiên cứu tốt ? ● Mục đích, mục tiêu nghiên cứu rõ ràng ● Quá trình nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu được hoạch định một cách chi tiết ● Giới hạn của nghiên cứu được trình bày rõ ràng, chính xác. ● Đảm bảo tiêu chuẩn đạo đức nghiên cứu (sao chép, tự tạo dữ liệu) Nghiencuudinhluong.com

17. Quy trình một luận văn 5 chương ● (Phần này dành cho các bạn học viên cao học, sinh viên tham khảo về cách thiết lập tổng quát một nghiên cứu định lượng) ● Một luận văn nghiên cứu định lượng thông thường gồm 5 chương (các trường có thể có hướng dẫn chi tiết khác nhau, nhưng tựu chung có sự tương đồng). Cụ thể như sau: Nghiencuudinhluong.com

18. Quy trình một luận văn 5 chương ● Phần 1 Giới thiệu: Giới thiệu về việc hình thành đề tài, lý do, câu hỏi nghiên cứu, mục đích nghiên cứu, quy trình thực hiện nghiên cứu… ● Phần 2 Lý thuyết (hoặc tổng quan lý thuyết): Giới thiệu về các khái niệm về các nhân tố (biến) và các mối quan hệ, các mô hình mô tả mối quan hệ giữa chúng…. Nghiencuudinhluong.com

19. Quy trình một luận văn 5 chương ● Phần 3 Phương pháp nghiên cứu: Giới thiệu về các phương pháp để thực hiện nghiên cứu như thế nào (điều tra, chọn mẫu, thiết kế câu hỏi, phương pháp phân tích sẽ sử dụng : thống kê – mô tả, phân tích nhân tố, sử dụng phương trình cấu trúc….) ● Phần 4 Kết quả nghiên cứu: Trình bày các kết quả nghiên cứu thu được Nghiencuudinhluong.com

20. Quy trình một luận văn 5 chương ● Phần 5 Kết luận và kiến nghị (đưa ra kết luận chính, những kiến nghị, đề xuất từ kết quả, những đóng góp và ý nghĩa của nghiên cứu, những hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo) Nghiencuudinhluong.com

21. Giới thiệu về phần mềm SPSS ● SPSS là phần mềm thống kê được sử dụng phổ biến cho các nghiên cứu điều tra xã hội học và kinh tế lượng. ● SPSS có giao diện thân thiện với người dùng, dễ sử dụng. Nghiencuudinhluong.com

22. CÁC CÔNG CỤ PHÂN TÍCH CHÍNH TRÊN SPSS * Thống kê mô tả * Kiểm định sự tin cậy thang đo (Cronbach Alpha test) * Phân tích khám phá nhân tố (EFA) * Phân tích tương quan * Phân tích hồi quy * Phân tích phương sai (ANOVA) * Các phân tích khác: Kiểm định phi tham số, vẽ bản đồ nhận thức, hồi quy Logistic Nghiencuudinhluong.com

23. Nhắc lại về thống kê mô tả ● Trung bình (kỳ vọng toán): ● Phương sai ● Độ lệch chuẩn ● Khoảng biến thiên, độ nhọn và độ bất đối xứng (xem xét phân phối của dữ liệu), trung vị, mode ● 4 loại thang đo và phân biệt 2 từ “thang đo” ● Thực hành trên file dữ liệu mẫu

24. Tài liệu tham khảo ● Suanders.M, Lewis và Thornhill (2010), Phương pháp nghiên cứu trong kinh doanh, Nhà xuất bản Tài chính (dịch giả Nguyễn Văn Dung). ● Nguyễn Đình Thọ (2011), Phương pháp nghiên cứu khoa học trong kinh doanh: Thiết kế và thực hiện, Nhà xuất bản Lao động – xã hội Nghiencuudinhluong.com

25. Tài liệu tham khảo ● Lê Văn Huy và Trương Trần Trâm Anh (2012), Phương pháp nghiên cứu trong kinh doanh, Nhà xuất bản Tài chính. ● Hoàng Trọng và Chu Nguyễn Mộng Ngọc (2008), Phân tích dữ liệu nghiên cứu với SPSS – 2 tập – Nhà xuất bản Hồng Đức. ● Nguyễn Quang Dong (2012), Kinh tế lượng, Nhà xuất bản ĐHKTQD Nghiencuudinhluong.com

26. Tài liệu tham khảo ● Tiếng Anh: Tài liệu của Kothari (2004), phân tích dữ liệu đa biến của Hair et al (2006) Nghiencuudinhluong.com