Bạn đang xem bài viết Tiêu Chuẩn Quốc Gia Tcvn 7902:2008 (Iso 15213 : 2003) Về Vi Sinh Vật Trong Thực Phẩm Và Thức Ăn Chăn Nuôi được cập nhật mới nhất tháng 12 năm 2023 trên website Channuoithuy.edu.vn. Hy vọng những thông tin mà chúng tôi đã chia sẻ là hữu ích với bạn. Nếu nội dung hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất.
VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN KHỬ SULFIT PHÁT TRIỂN TRONG ĐIỀU KIỆN KỴ KHÍ
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of sulfite-reducing bacteria growing under anaerobic conditions Lời nói đầu
TCVN 7902:2008 hoàn toàn tương đương với ISO 15213:2003;
TCVN 7902:2008 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Lời giới thiệu
Do tính đa dạng của thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nên phương pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp này, có thể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu hoàn toàn chỉ vì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp này khi có thể.
Việc hài hòa các phương pháp thử có thể không thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm có thể tồn tại các tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn này. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn cho sản phẩm cần thử nghiệm thì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Thông thường khi các tiêu chuẩn đó được soát xét, thì chúng phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, sao cho cuối cùng chỉ còn các sai lệch với phương pháp đếm đĩa này là vì các lý do kỹ thuật được thừa nhận.
VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN KHỬ SULFIT PHÁT TRIỂN TRONG ĐIỀU KIỆN KỴ KHÍ Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of sulfite-reducing bacteria growing under anaerobic conditions
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi khuẩn khử sulfit phát triển trong điều kiện kỵ khí. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
– các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi, và
– cho các mẫu môi trường trong khu vực chế biến và vận chuyển thực phẩm.
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.
TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh
TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.
TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi ư Hướng dẫn chuẩn bị và tạo môi trường cấy – Phần 1: Các hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị môi trường cấy trong phòng thử nghiệm).
3. Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:
3.1. Vi khuẩn khử sulfit phát triển trong điều kiện kỵ khí (sulfite-reducing bacteria growing under anaerobic conditions)
Các vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình có thể đếm được dưới các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này.
4.1. Chuẩn bị hai đĩa (hoặc ống) thạch, sử dụng môi trường sắt sulfit và một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng xác định huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác.
Chuẩn bị hai đĩa (hoặc ống) thạch khác, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu, dưới cùng một điều kiện.
4.2. Ủ ấm các đĩa (hoặc ống) dưới điều kiện kỵ khí ở 37 0C ± 1 0C trong 24 h đến 48 h (đọc kết quả cuối cùng sau 48 h), hoặc có thể ủ ở 50 0 C nếu nghi ngờ có vi khuẩn ưa nhiệt. Đếm các khuẩn lạc màu đen điển hình. Màu đen của các khuẩn lạc và quầng bao quanh là kết quả của việc hình thành sắt (II) sulfua do phản ứng giữa các ion sulfua và sắt hóa trị ba [Fe(III)] có mặt trong môi trường.
4.3. Tính số lượng vi khuẩn khử sulfit trên mililit hoặc gam mẫu thử từ số lượng khuẩn lạc thu được trên các đĩa (hoặc ống).
5. Môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng
Về thực hành thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218).
5.1. Môi trường đếm đĩa: Thạch sắt sulfit 5.1.1 Thành phần 5.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên trong nước, bằng cách đun nóng.
Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng pH là 7,6 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần.
Rót môi trường với các lượng 250 ml vào các bình cầu 500 ml.
Nếu tiến hành việc định lượng sử dụng các ống nghiệm (6.5) thì rót 20 ml hoặc 25 ml môi trường vào các ống nghiệm. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 0 C.
Trước khi sử dụng, đuổi khí môi trường.
5.2. Dung dịch pha loãng muối pepton
Xem 5.2.1 của TCVN 6507-1 (ISO 6887-1:1999).
6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:
6.1. Dụng cụ đồng hóa, dùng cho các mẫu thực phẩm dạng rắn [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].
6.2. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ ở khoảng từ 44 0C đến 47 0 C.
6.3. Bình kỵ khí, có bộ phận tạo môi trường kỵ khí và có cả hệ thống kiểm tra các điều kiện kỵ khí.
6.4. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 37 0C ± 1 0C và ở 50 0C ± 1 0 C, nếu cần.
6.5. Ống nghiệm, kích thước 16 mm x 160 mm và bình cầu hoặc chai có dung tích 500 ml.
Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
9.1. Yêu cầu chung
Sơ đồ cách tiến hành được nêu trong Phụ lục A.
9.3. Nuôi cấy
Lấy hai đĩa Petri vô trùng. Dùng pipet vô trùng chuyển sang mỗi đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác.
Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác. Dùng pipet vô trùng mới chuyển sang mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-1) của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất của huyền phù ban đầu (10-2) nếu sản phẩm ở dạng khác.
Lặp lại quy trình trên với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng mỗi pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng.
Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 15 ml thạch sắt sulfite (5.1) đã được làm nguội đến nhiệt độ từ 44 0C đến 47 0 C trên nồi cách thủy (6.2). Thời gian tính từ lúc nuôi cấy các đĩa Petri đến khi thêm thạch không được vượt quá 15 min. Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách đưa đĩa qua lại theo phương nằm ngang và để yên cho môi trường đông đặc lại.
Sau khi môi trường đã đông đặc, phủ cùng loại môi trường lên đĩa với lượng từ 5 ml đến 10 ml.
Nếu dùng ống nghiệm thì cấy vào hai ống đựng môi trường để ở 44 0C đến 47 0 C, mỗi ống 1 ml mỗi dung dịch pha loãng. Trộn nhẹ, không để tạo bọt và để yên cho môi trường đông đặc lại trên nồi cách thủy lạnh (6.2).
Sau khi môi trường đã đông đặc, phủ cùng loại môi trường lên mỗi ống với lượng từ 2 ml đến 3 ml.
9.4. Ủ ấm
Sau khi đã đông đặc, ủ ấm các đĩa Petri trong các bình kỵ khí (6.3) ở 37 0C ± 1 0 C trong 24 h đến 48 h.
Nếu nghi ngờ có vi khuẩn ưa nhiệt, thì chuẩn bị một dãy các đĩa Petri thứ hai (xem 9.3). Ủ ấm dãy đĩa này ở 50 0C ± 1 0 C.
Trong trường hợp dùng các ống, không cần phải ủ trong các bình kỵ khí.
9.5. Đếm khuẩn lạc
Đọc kết quả sau 24 h và 48 h, tùy vào độ đen và tốc độ phát triển của các vi sinh vật. Đếm các khuẩn lạc màu đen, có thể có quầng đen bao quanh được coi là vi khuẩn khử sulfit.
CHÚ THÍCH 1 Có thể xuất hiện quầng đen lan rộng không đặc trưng của môi trường, đặc biệt là khi nuôi cấy trong các ống thạch thay cho các đĩa Petri. Việc phát triển các vi khuẩn kỵ khí, mà chỉ sinh khí hydro (không phải là H 2 S) cũng có thể khử sulfit có mặt dẫn đến làm đen môi trường.
Đếm các khuẩn lạc của vi khuẩn khử sulfit trong mỗi đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc điển hình và chứa ít hơn 300 khuẩn lạc tổng số.
Khi số lượng khuẩn lạc cao, thì một số ống có thể không đếm được. Trong trường hợp này, chỉ có các ống có các khuẩn lạc mọc tách biệt rõ ràng mới dùng để đếm.
CHÚ THÍCH 2 Tiêu chuẩn này chỉ có thể sử dụng để định lượng chỉ Clostridium. Sau khi thu được các khuẩn lạc đặc trưng, từ mỗi đĩa lấy năm khuẩn lạc và được dùng để khẳng định chi Clostridium bằng các phép thử khẳng định (ví dụ, các phép thử hô hấp, sinh bào tử).
10. Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy
Xem phần bổ sung của TCVN 6404 (ISO 7218).
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng, kể cả nhiệt độ ủ ấm, việc sử dụng ống nghiệm và bất kỳ việc xử lý nhiệt nào để diệt vi khuẩn sinh dưỡng;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
e) các kết quả thử nghiệm thu được;
Báo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] NMKL No. 95:1997, Sulfite-reducing Clostridia – Determination in food .
Tiêu Chuẩn Quốc Gia Tcvn 4882:2007 (Iso 4831 : 2006) Về Vi Sinh Vật Trong Thực Phẩm Và Thức Ăn Chăn Nuôi
TCVN 4882 : 2007 ISO 4831 : 2006
VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM – KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizotal method for the detection and enumeration of coliforms – Most probable number technique Lời nói đầu
TCVN 4882 : 2007 thay thế TCVN 4882 : 2001 và TCVN 6262-1 : 1997;
TCVN 4882 : 2007 hoàn toàn tương đương với ISO 4831 : 2006;
TCVN 4882 : 2007 do Ban Kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Lời giới thiệu
Do tính đa dạng của thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nên phương pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp này, có thể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu hoàn toàn chỉ vì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp này khi có thể.
Việc hài hòa các phương pháp thử có thể không thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm có thể tồn tại các tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn này. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm thì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Thông thường khi các tiêu chuẩn như thế được soát xét, thì chúng phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, sao cho cuối cùng chỉ còn các sai lệch với phương pháp đếm đĩa này là các lý do kỹ thuật được thừa nhận.
Kỹ thuật mô tả trong tiêu chuẩn này có độ chính xác thấp hơn so với kỹ thuật mô tả trong TCVN 6848 : 2007 (ISO 4832)[1], nhưng cho phép kiểm tra vi sinh vật khi thực hiện trên mẫu thử lớn, do đó, phương pháp này cho phép phát hiện lượng coliform trong một gam hoặc một mililit mẫu thử với số lượng thấp hơn. Ngoài ra, do định nghĩa “coliform” trong hai tiêu chuẩn này khác nhau, nên các vi sinh vật đếm được là không cần thiết phải giống nhau.
Đối với sản phẩm cụ thể bất kỳ thì phương pháp được chọn sẽ được qui định trong tiêu chuẩn đối với sản phẩm đó.
Đối với mục đích của phương pháp thử thực tế, thì định nghĩa “coliform” đưa ra trong điều 3 và được sử dụng làm cơ sở cho qui trình là không cần thiết phải giống hệt với các định nghĩa tương ứng đưa ra trong các ấn bản khác. Tỷ lệ các chủng vi sinh được mô tả trong các ấn bản khác là “coliform” (bao gồm cả Ε.coli) không có khả năng tạo đủ khí để có thể phát hiện được bằng ống Durham (nghĩa là “các chủng kỵ khí”). Do đó phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này sẽ không phát hiện được các chủng vi sinh nêu trong các ấn bản khác là “coliform (giả định)” (ví dụ: các chủng cụ thể của Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella) (xem [2]).
VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM – KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizotal method for the detection and enumeration of coliforms – Most probable number technique 1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung để phát hiện và định lượng coliform. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
– các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, và
– các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.
Việc định lượng được thực hiện bằng cách tính số có xác suất lớn nhất (MPN) sau khi ủ trong môi trường lỏng ở 30 oC hoặc 37 o C.
Phương pháp định lượng này có thể sử dụng khi số lượng khuẩn lạc cần tìm dự kiến từ 1 đến 100 trên mililit hoặc trên gam mẫu thử.
Điểm hạn chế khi áp dụng của tiêu chuẩn này là kết quả có độ dao động lớn. Thông tin trong điều 11 đưa ra hướng dẫn về khả năng áp dụng của phương pháp và về việc diễn giải kết quả.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.
TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.
TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật.
TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị môi trường nuôi cấy – Phần 1: Các hướng dẫn chung để đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm).
ISO/TS 11133-2 : 2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị môi trường nuôi cấy – Phần 2: Các hướng dẫn thực hành các phép thử trên môi trường nuôi cấy).
3. Định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng các định nghĩa sau:
3.1
Vi khuẩn ở nhiệt độ qui định (nghĩa là ở 30 oC hoặc 37 o C như thỏa thuận) lên men lactoza có sinh khí dưới các điều kiện thử quy định trong tiêu chuẩn này.
3.2
Xác định sự có mặt hay không có mặt các vi khuẩn này trong một lượng xác định của sản phẩm, khi các phép thử được thực hiện theo quy định của tiêu chuẩn này.
3.3
Số có xác suất lớn nhất của coliform tìm thấy trong một gam hoặc một mililit mẫu thử, khi các phép thử được thực hiện theo quy định của tiêu chuẩn này.
4. Nguyên tắc 4.1 Phát hiện coliform 4.2 Đếm bằng kỹ thuật MPN 5. Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng 5.1 Khái quát
Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 về cách chuẩn bị, pha chế và tính năng thử nghiệm của môi trường.
5.3 Môi trường tăng sinh chọn lọc: Canh thang tryptoza lauryl sulfat 5.3.1 Thành phần 5.3.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần khác nhau hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.
Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4) chứa ống Durham (6.5) đối với môi trường nồng độ đơn, và vào các ống nghiệm có kích thước 20 mm x 200 mm (6,4) [không chứa các ống Durham (6.5)] đối với môi trường nồng độ kép.
Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 o C. Các ống Durham không được chứa các bọt khí sau khi khử trùng.
5.3.3 Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy
Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với canh thang tryptoza lauryl sulfat theo ISO/TS 11133-2 : 2003, Bảng B.1.
5.4 Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng (lactose bile brilliant green broth) 5.4.1 Thành phần 5.4.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng nhẹ, nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.
Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4) có ống Durham (6.5).
Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 o C. Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.
5.4.3 Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy
Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với canh thang mật lactoza lục sángtheo Bảng B.1 của ISO/TS 11133-2 : 2003.
6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh [TCVN 6263 (ISO 8261)] và cụ thể như sau:
(tủ sấy) hoặc 6.1 Thiết bị để khử trùng khô để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)
Xem TCVN 6404 (ISO 7218).
Ống nghiệm thu được trong 9.1.3.1 hoặc 9.1.3.2 cho thấy sinh khí sau 24 h ± 2 h và 48 h ± 2 h được coi là dương tính.
Chuẩn bị một số độ pha loãng đủ để đảm bảo rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.
9.2.2 Cấy và ủ
Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí trong 9.2.3 (các ống dương tính) sau 24 h ± 2 h và sau 48 h ± 2 h (nếu có).
10. Tính và biểu thị kết quả
Theo các kết quả diễn giải (xem 9.1.4), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt coliform trong phần mẫu thử x g hoặc x ml của sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].
Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng. Xem [TCVN 6404 (ISO 7218)].
11. Độ chụm
Với kỹ thuật MPN có thể cho kết quả với dao động lớn, do đó hết sức thận trọng khi sử dụng kết quả thu được bằng phương pháp này.
Giới hạn tin cậy được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218).
12. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
– phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
– mục đích của phép thử và nhiệt độ ủ đã sử dụng;
– tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.
– các kết quả thử nghiệm thu được.
Phụ lục A Sơ đồ về cách tiến hành
Hình A.1 – Phương pháp phát hiện
Hình A.2 – Phương pháp định lượng
Hình A.3 – Các chi tiết về bước khẳng định THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 6848 (ISO 4832) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng coliform – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.
[2] EDWARD, Ρ.R. and EWING, W.H. Indentification of Enterobacteriaceae 3 rd edition, Burgess Publishing Company, Minneapolis, USA, 1972.
Tiêu Chuẩn Quốc Gia Tcvn 6123:2007 (Iso 3596:2000) Về Dầu Mỡ Động Vật Và Thực Vật
TCVN 6123:2007 ISO 3596:2000
DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH CHẤT KHÔNG XÀ PHÒNG HÓA – PHƯƠNG PHÁP DÙNG CHẤT CHIẾT DIETYL ETE
Animal and vegetable fats and oils – Determination of unsaponifiable matter – Method using diethyl ether extraction
Lời nói đầu
TCVN 6123:2007 thay thế TCVN 6123 -1:1996 và TCVN 6123 -2:1996;
TCVN 6123:2007 hoàn toàn tương đương với ISO 3596:2000;
TCVN 6123:2007 do Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH CHẤT KHÔNG XÀ PHÒNG HÓA – PHƯƠNG PHÁP DÙNG CHẤT CHIẾT DIETYL ETE 1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp dùng chất chiết dietyl ete để xác định hàm lượng chất không xà phòng hóa của dầu mỡ động vật và thực vật.
Phương pháp này không áp dụng cho sáp. Phương pháp này cho kết quả gần đúng với các loại mỡ có hàm lượng chất không xà phòng hóa cao, ví dụ: đối với các loại mỡ thu được từ các loài động vật biển.
Có thể sử dụng phương pháp quy định trong ISO 18609 nếu do điều kiện khí hậu hoặc yếu tố luật pháp không cho phép sử dụng dietyl ete.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.
TCVN 6128:2007 (ISO 661:2003), Dầu mỡ động vật và thực vật. Chuẩn bị mẫu thử.
3. Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:
tất cả các chất có trong sản phẩm, sau khi đã xà phòng hóa bởi kali hydroxit (KOH) và chiết bởi dung môi quy định không bay hơi dưới các điều kiện thao tác đã được quy định.
4. Nguyên tắc
Xà phòng hóa dầu hoặc mỡ bằng cách đun sôi dưới dạng hồi lưu với dung dịch kali hydroxit trong etanol, chiết chất không xà phòng hóa từ dung dịch xà phòng bằng dietyl ete cho bay hơi dung môi và cân cặn sau khi đã sấy khô.
5. Thuốc thử
Tất cả các loại thuốc thử phải thuộc loại tinh khiết phân tích, nước sử dụng là nước cất hoặc khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
mới chưng cất không có peroxit và cặn 5.1. Dietyl ete, .
5.2. Axeton.
Hòa tan 60 g kali hydroxit (KOH) trong 50 ml nước và pha loãng tới 1 000 ml bằng etanol 95 % (theo thể tích). Dung dịch phải không màu hoặc màu vàng nhạt.
6. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
6.4. Nồi cách thủy. 7. Lấy mẫu
Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện, không bị hư hỏng và thay đổi trong quá trình bảo quản và vận chuyển.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 2625:2007 (ISO 5555:2001).
8. Chuẩn bị mẫu thử
Mẫu thử được chuẩn bị theo TCVN 6128:2007 (ISO 661:2003).
9. Tiến hành thử 9.1. Phần mẫu thử
Cân khoảng 5 g mẫu thử chính xác đến 0,01 g (điều 8) cho vào bình 250 ml (6.1).
9.2. Xà phòng hóa
Thêm 50 ml dung dịch kali hydroxit (5.3) và thêm vài hạt chống trào, gắn bộ sinh hàn (6.2) vào bình và đun sôi nhẹ trong 1 h. Ngừng đun và thêm 100 ml nước từ phía trên bình sinh hàn và xoay.
Nếu như chiết chất không xà phòng hóa với mục đích xác định thành phần tocopherol thì việc thêm pyrogalol là cần thiết, chiết phải hoàn thành nhanh (trong vòng 30 min).
9.3. Chiết chất không xà phòng hóa
Sau khi làm nguội chuyển dung dịch sang phễu chiết 500 ml (6.3). Rửa bình và chất chống trào vài lần với dietyl ete (5.1), dùng tổng cộng 100 ml và rót nước rửa sang phễu chiết. Đậy nút và lắc đều liên tục trong vòng 1 min, thỉnh thoảng cân bằng áp suất bằng cách lật phễu chiết, thỉnh thoảng mở khóa vòi.
Để yên cho đến khi hai pha được tách ra hoàn toàn, sau đó gạn lớp lắng phía dưới càng nhiều càng tốt vào phễu chiết thứ hai.
Nếu hình thành thể nhũ thì phải phá hủy nó bằng cách thêm một lượng nhỏ etanol hoặc kali hydroxit đậm đặc hoặc dung dịch natri clorua.
Chiết dung dịch xà phòng ở trong etanol ít nhất hai lần, theo cùng một phương thức với 100 ml dietyl ete. Gộp ba dịch chiết của ete vào một phễu chiết có chứa 40 ml nước.
9.4. Rửa phần chiết ete
Xoay nhẹ phễu chiết chứa các chất chiết hỗn hợp và 40 ml nước.
Để cho các lớp tách riêng hoàn toàn, tháo bỏ lớp nước phía dưới. Rửa dung dịch ete ít nhất hai lần, mỗi lần 40 ml nước, lắc mạnh, mỗi lần như vậy loại bỏ lớp nước ở dưới và mỗi lần giữ lại 2 ml sau đó xoay phễu chiết quanh trục của nó. Đợi vài phút để thu lớp nước còn lại. Hút hết nước đó, đóng khóa vòi, khi dung dịch ete vừa chạm tới khóa vòi.
Rửa dung dịch ete với 40 ml dung dịch kali hydroxit (5.4), 40 ml nước và rửa lại với 40 ml dung dịch kali hydroxit, sau đó rửa lại ít nhất là 2 lần với 40 ml nước. Tiếp tục rửa với nước đến khi nước rửa không còn mầu hồng, khi thêm một giọt phenolphtalein (5.5).
9.5. Bay hơi dung môi
Chuyển lượng dung dịch ete mỗi lần một ít qua đỉnh phễu chiết sang bình 250 ml (6.1) đã sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 103 C (6.5), được làm nguội và cân chính xác đến 0,1 mg. Cho bay hơi dung môi trong nồi cách thủy (6.4).
Thêm 5 ml axeton (5.2) và cho bay hơi dung môi hoàn toàn trong luồng không khí nhẹ, giữ bình nằm nghiêng trong nồi cách thủy khi quay.
9.6. Sấy khô cặn và tiến hành xác định
Sấy phần cặn trong tủ sấy (6.5) ở 103 o C trong 15 phút và để bình ở trạng thái nằm ngang. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0,1 mg. Lặp lại chu kỳ sấy 15 phút đến khi sự chênh lệch của khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp nhỏ hơn 1,5 mg. Nếu khối lượng thu được sau ba lần sấy vẫn thay đổi thì chất không xà phòng hóa có thể bị nhiễm bẩn và phải xác định lại.
CHÚ THÍCH: Nếu có thể được, có thể dùng máy cô quay chân không, đặc biệt nếu như chất không xà phòng hóa, cần xác định tiếp.
9.7. Số phép xác định
Thực hiện hai phép xác định trên cùng một mẫu thử.
9.8. Phép thử trắng
Tiến hành thử mẫu trắng cùng một trình tự và cùng một lượng của các loại thuốc thử, nhưng bỏ qua phần mẫu thử. Nếu phần cặn lớn hơn 1,5 mg, thì xem xét lại phần thao tác kỹ thuật và thuốc thử.
10. Biểu thị kết quả
Hàm lượng chất không xà phòng hóa tính theo phần trăm (%) khối lượng của mẫu thử, bằng công thức sau:
là thể tích của dung dịch chuẩn kali hydroxit trong etanol đã dùng để chuẩn độ, tính bằng mililit;
là nồng độ chính xác phần của dung dịch chuẩn kali hydroxit trong etanol, tính bằng mol trên lít.
Kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định.
11. Độ chụm
Chi tiết thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được tổng hợp trong Phụ lục A. Giá trị nhận được từ kết quả thử liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng với giải nồng độ và chất nền (matrix) ngoài phạm vi đã cho.
12. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
– mọi chi tiết cần thiết cho việc nhận biết mẫu đầy đủ;
– phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
– phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
– mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có ảnh hưởng đến kết quả thử;
– kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại, thì ghi kết quả cuối cùng thu được.
Kết quả thử liên phòng thử nghiệm A.1. Thử quốc tế liên phòng thử nghiệm với 51 phòng thử nghiệm ở 16 nước, tiến hành với:
Mẫu A: Dầu đậu tương, khử mùi tẩy màu và tinh chế; và
Mẫu B: Dầu đậu tương khô đã thủy hóa và sấy khô, sử dụng phương pháp dietyl ete.
Việc thử này do liên đoàn Dầu mỡ và hiệp hội Hạt và Chất béo tổ chức (FOSFA quốc tế) tháng 6 năm 1995 và kết quả đã được xử lý phân tích thống kê theo ISO 5725 cho độ chính xác chỉ ra trong Bảng A.1.
Bảng A.1
Phép thử này do liên đoàn Dầu mỡ và hiệp hội Hạt và Chất béo tổ chức (FOSFA Quốc tế) và kết quả đã được xử lý phân tích thống kê theo ISO 5725 1) cho độ chính xác nêu trong Bảng A.2
Bảng A.2
Thử liên phòng quốc tế lần thứ 3 gồm 17 phòng thử nghiệm do IUPAC tổ chức từ năm 1976 đến năm 1997. Kết quả đã được xử lý phân tích thống kê theo ISO ISO 5725 cho số liệu chính xác nêu trong Bảng A.3.
Bảng A.3 Thư mục tài liệu tham khảo
[1] TCVN 2625:2007 (ISO 5555:2001), Dầu mỡ động vật và thực vật. Lấy mẫu.
[2] ISO 5725:1986, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for standard tests methods by inter-laboratory tests (hiện nay đã hủy).
[3] ISO 18609, Animal and vegetable fats and oils – Determination of unsaponifiable matter – Method using hexane extraction.
Kiểm Nghiệm Vi Sinh Có Trong Thực Phẩm, Thức Ăn Chăn Nuôi, Nước
QCVN chuyên thực hiện các dịch vụ phân tích các chỉ tiêu vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, thủy sản, sản phẩm thủy sản, nông sản thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản, nước uống, nước sinh hoạt, nước thải, các sản phẩm mỹ phẩm…. nhằm đánh giá tình trạng vệ sinh, tình trạng ô nhiễm, ngộ độc về mặt vi sinh như: tổng số vi sinh vật, Coliform, Coliform phân, E.Coli, Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, …
Phân loại các loại vi sinh có trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nước, mỹ phẩm
Vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị:
Tổng số vi sinh vật, Coliforms, Coliform chịu nhiệt, Escherichia coli, Enterobacteriaceae, Clostridium perfringens, Salmonella spp, Shigella spp., Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococci dương tính với coagulase, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Alicyclobacillus, Tổng số nấm mốc-nấm men, Aspergillus flavus, Vi khuẩn kỵ khí khử sulfite, Pseudomonas aeruginosa, Intestinal enterococci, Candida albicans ….
Vi sinh vật có lợi: Lactic acid bacteria, Lactobacillus spp., Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, …
Vi sinh trong phân bón: Vi sinh vật cố định đạm, Vi sinh vật phân giải photpho khó tan (lân), Vi sinh vật phân giải xenlulo, …
2. Nền mẫu phân tích– Thực phẩm (nông sản thực phẩm, phụ gia thực phẩm, sữa và sản phẩm sữa, thủy sản và sản phẩm thủy sản, đồ uống, probiotics, thực phẩm chức năng …);
– Thức ăn chăn nuôi (thức ăn thủy sản, thức ăn gia súc, phụ gia thức ăn chăn nuôi, …);
– Nước (nước thải, nước sinh hoạt, nước ăn uống, nước ngầm, nước sản xuất, nước uống đóng chai, nước khoáng, nước đá,..);
– Mỹ phẩm, nguyên liệu mỹ phẩm, hóa mỹ phẩm, chất tẩy rửa; Phân bón vi sinh vật;
– Chế phẩm sinh học, sản phẩm xử lý môi trường, xử lý ao hồ;
– Các mẫu giám sát môi trường khu vực sản xuất (không khí, bề mặt làm việc, tay công nhân,..)
3. Phương pháp thử nghiệm:ISO, TCVN, FDA, BS, IFU, DĐVN, TCCS
QCVN với hơn 22 năm kinh nghiệm trong ngành kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm: đội ngũ chuyên gia, kỹ thuật viên có trình độ cao; Máy móc, thiết bị hiện đại; Đầu tư nghiên cứu phát triển áp dụng quy trình quốc tế xuyên suốt các khâu; Chất lượng dịch vụ luôn được quan tâm và cải tiến liên tục.
CÔNG TY CP KỸ THUẬT TIÊU CHUẨN QCVN VIỆT NAMTrung tâm: 67/2/8 Đường số 5, Phường 17, Quận Gò Vấp, TP.HCM
Điện thoại: 0287 308 6678 – Hotline: 0919 98 48 39
Email: [email protected]
Gửi báo giá theo yêu cầu
Tiêu Chuẩn Quốc Gia Tcvn 10480:2014 (Iso 18609:2000) Về Dầu Mỡ Động Vật Và Thực Vật
DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH CHẤT KHÔNG XÀ PHÒNG HÓA – PHƯƠNG PHÁP CHIẾT BẰNG HEXAN
Animal and vegetable fats and oils – Determination of unsapointiable matter – Method using hexan extration Lời nói đầu
TCVN 10480:2014 hoàn toàn tương đương với ISO 18609:2000;
TCVN 10480:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Animal and vegetable fats and oils – Determination of unsapointiable matter – Method using hexan extration
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chiết hexan ba lần để xác định hàm lượng chất không xà phòng hóa có trong dầu mỡ động vật và thực vật.
Phương pháp này áp dụng cho tất cả các loại dầu mỡ nhưng không áp dụng cho các loại sáp.
CẢNH BÁO – So với phương pháp nêu trong TCVN 6123 (ISO 3596) thì các phương pháp hiện nay đều cho các kết quả thấp.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6128 (ISO 661), Dầu mỡ động vật và thực vật– Chuẩn bị mẫu thử.
3. Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:
Tất cả các chất có mặt trong sản phẩm được chiết bằng hexan, sau khi xà phòng hóa bằng kali hydroxit không bay hơi theo các điều kiện thao tác quy định.
CHÚ THÍCH: Chất Không xà phòng hòa bao gồm các lipid có nguồn gốc tự nhiên như các sterol, các hydrocacbon và ancol bậc cao hơn, ancol aliphatic, ancol terpenic, cũng như tất cả các chất hữu cơ ngoại lai được chiết bằng dung môi và không bị bay hơi ở 103 °C (ví dụ dầu khoáng) có thể có mặt.
Xà phòng hóa dầu hoặc mỡ bằng cách đun sôi hồi lưu với dung dịch kali hydroxit trong etanol. Chiết chất không xà phòng hóa từ dung dịch xà phòng bằng hexan hoặc nếu không có thì chiết bằng dầu nhẹ. Làm bay hơi dung môi và cân phần cặn sau khi sấy.
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
5.1.n-Hexan hoặc nếu không có thì sử dụng dầu nhẹ, nhiệt độ chưng cất từ 40 °C đến 60 °C, trị số brom nhỏ hơn 1. Cả hai dung môi phải không chứa cặn.
5.4.Dung dịch kali hydroxit, trong etanol, c(KOH) ≈ 1 mol/l.
Hòa tan 60 g kali hydroxit trong 50 ml nước và thêm etanol 95 % (thể tích) đến 1 000 ml. Dung dịch phải không màu hoặc có màu vàng nhạt.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của thử nghiệm và cụ thể như sau:
6.5.Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ ở 103 °C ± 2 °C, hoặc thiết bị sấy dưới chân không, ví dụ: bộ cô quay hoặc thiết bị tương tự.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 2625 (ISO 5555) [2].
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6128 (ISO 661).
Cân khoảng 5 g mẫu thử (Điều 8), chính xác đến 0,01 g, cho vào bình cầu 250 ml (6.1).
Thêm 50 ml dung dịch kali hydroxit (5.4) và vài hạt chống sôi trào. Nối bộ sinh hàn (6.2) vào bình cầu và đun sôi nhẹ lượng chứa trong bình trong 1 h. Ngừng đun nóng. Thêm 50 ml nước qua phía trên bình sinh hàn và lắc.
Sau khi làm nguội, chuyển dung dịch sang phễu chiết 250 ml (6.3). Tráng rửa bình và các hạt chống sôi trào vài lần bằng hexan (5.1), dùng tổng cộng 50 ml và rót nước tráng rửa sang phễu chiết. Đậy nắp và lắc mạnh trong 1 min, thỉnh thoảng cân bằng áp suất bằng cách đảo chiều phễu chiết và cẩn thận mở khóa vòi.
Để yên cho đến khi hai pha tách ra hoàn toàn. Sau đó thu lấy lớp phía dưới càng nhiều càng tốt vào phễu chiết thứ hai.
Nếu tạo huyền phù thì phải loại bỏ huyền phù bằng cách thêm một lượng nhỏ etanol hoặc dung dịch kali hydroxid hoặc dung dịch natri clorua đậm đặc.
Chiết dung dịch xà phòng trong etanol ít nhất hai lần, mỗi lần bằng 50 ml hexan theo cùng một cách. Thu ba dịch chiết hexan vào một phễu chiết
Rửa hỗn hợp dịch chiết ba lần mỗi lần bằng 25 ml dung dịch etanol (5.2), lắc mạnh và loại bỏ pha nước sau mỗi lần rửa. Mỗi lần loại bỏ dung dịch rửa để lại 2 ml sau đó xoay phễu chiết quanh trục củanó. Đợi vài phút để lớp nước etanol thu lại. Loại bỏ hết lớp nước etanol này, đóng khóa vòi khi dung dịch hexan vừa chạm tới khóa.
Tiếp tục rửa bằng dung dịch etanol cho đến khi nước rửa không còn tạo màu hồng khi thêm một giọt dung dịch phenolphtalein (5.3).
Chuyển định lượng dung dịch hexan, mỗi lần một ít nếu cần, từ phễu chiết sang bình cầu 250 ml (6.1) đã sấy trước ở 103 °C trong tủ sấy (6.5), sau đó làm nguội và cân chính xác đến 0,1 mg. Làm bay hơi dung môi trong nồi cách thủy đun sôi (6.4).
9.6.1. Sấy phần cặn 15 min trong tủ sấy (6.5) cài đặt ở 103 °C, đặt bình ở vị trí gần như nằm ngang. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0,1 mg.
Cách khác, nối bình cầu với thiết bị cô quay chân không (6.5) và làm khô trên nồi cách thủy đun sôi dưới chân không tối đa của bơm trong khoảng 15 min. Làm nguội đến nhiệt độ phòng dưới chân không tối đa của bơm, lau bình cẩn thận và cân chính xác đến 0,1 mg.
Lặp lại quá trình sấy liên tiếp trong các khoảng thời gian 15 min đến khi hao hụt khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp nhỏ hơn 1,5 mg. Nếu khối lượng thu được vẫn thay đổi sau ba lần sấy thì chất không xà phòng hóa có thể bị nhiễm bẩn và phải tiến hành xác định lại.
9.6.2.Nếu cần hiệu chính đối với các axit béo tự do, sau khi cân phần cặn thì hòa tan cặn trong 4 ml hexan (5.1) và thêm 20 ml etanol đã được trung hòa đến khi có màu hồng nhạt khi thêm phenolphtalein (5.3) làm chất chỉ thị. Chuẩn độ bằng dung dịch thể tích chuẩn kali hydroxit trong etanol, c(KOH) = 0,1 mol/l, cho đến khi màu cuối cùng như nhau. Tính khối lượng axit béo tự do theo axit oleic và hiệu chỉnh khối lượng cặn tương ứng (xem Điều 10).
Tiến hành hai phép xác định trên cùng một mẫu thử.
Tiến hành phép thử trắng, sử dụng cùng một quy trình và cùng lượng thuốc thử nhưng không có phần mẫu thử. Nếu khối lượng phần cặn vượt quá 1,5 mg thì kiểm tra lại kỹ thuật thao tác và thuốc thử.
Hàm lượng chất không xà phòng hóa, tính bằng phần trăm khối lượng của mẫu, theo công thức:
Trong đó
m0 là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
m2 là khối lượng cặn thu được của mẫu trắng, tính bằng gam (g);
là khối lượng axit béo tự do, nếu có và bằng 0,28 V x c, tính bằng gam (g)
Trong đó
là thể tích của dung dịch thể tích chuẩn kali hydroxit trong etanol dùng để chuẩn độ (9.6.2), tính bằng mililit (ml);
là nồng độ chính xác của dung dịch thể tích chuẩn kali hydroxit trong etanol, tính bằng mol trên lít (mol/l).
Lấy kết quả là trung cộng của hai phép xác định.
Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được trong các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền mẫu khác với các giá trị đã nêu.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
– phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
– tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
– các kết quảthử nghiệm thu được, hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
(Tham khảo)
Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm
Có mười bốn phòng thử nghiệm đến từ sáu quốc gia khác nhau (Pháp, Đức, Hungary, Malaysia, Hà Lan, Vương Quốc Anh) đã tham gia vào một nghiên cứu cộng tác do Trung tâm kỹ thuật công nghệ Viện cây trồng tổ chức.
Chuẩn bị ba mẫu:
– Mẫu A: dầu hướng dương thô;
– Mẫu B: dầu cọ thô;
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
– Mẫu C: mỡ động vật thô.
Bảng A.1. A.2 và A.3 cho các kết quả thu được từ các phòng thử nghiệm đối với ba mẫu A, B và C. Bảng A.4 cho các kết quả thống kê theo từng mẫu.
Hai phòng thử nghiệm đã bị loại trừ mẫu A dựa vào phép thử Cochran (Phòng thử nghiệm 6) và phép thử Dixon (Phòng thử nghiệm 9), một phòng thử nghiệm đã bị loại trừ mẫu C dựa vào phép thử Dixon (Phòng thử nghiệm 11) và không có phòng thử nghiệm nào bị loại trừ mẫu B.
Các giá trị trung bình đối với hàm lượng chất không xà phòng hóa trong ba mẫu thử trong khoảng từ 0,15 % đến 0,58 % (tính theo khối lượng).
Giới hạn lập lại khoảng 0,06 % (tính theo khối lượng) và các giá trị hệ số biến thiên lặp lại trong khoảng từ 3,6 % đến 10,5 %.
Giới hạn tái lập khoảng 0,18 % (tính theo khối lượng) và các giá trị hệ số biến thiên tái lập trong khoảng từ 9 % đến 36 %.
[1] TCVN 6123 (ISO 3596), Dầu mỡ động vật và thực vật – Xác định chất không xà phòng hóa – Phương pháp dùng chất chiết dietyete.
[2] TCVN 2625 (ISO 5555), Dầu mỡ động vật và thực vật – Lấy mẫu.
Tiêu Chuẩn Quốc Gia Tcvn 9514:2012 Về Thực Phẩm
TCVN 9514:2012
THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B 12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Foodstuffs – Determination of vitamin B12 by high performance liquid chromatography (HPLC) Lời nói đầu
TCVN 9514:2012 được xây dựng trên cơ sở AOAC 2011.10 Vitamin B12 in infant formula and adult nutritionals. High-performance liquid chromatography;
TCVN 9514:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Foodstuffs – Determination of vitamin B12 by high performance liquid chromatography (HPLC) 1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin B 12 trong thực phẩm bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trên các mẫu thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh và sản phẩm bổ sung vitamin B 12 dành cho người lớn. Để có thêm thông tin về các dữ liệu đã được đánh giá xác nhận ở trên, xem Phụ lục A.
2. Nguyên tắc
Vitamin B 12 được chiết ra khỏi mẫu thử bằng dung dịch đệm natri axetat (pH 4,5) và kali xyanua ở 105 oC. Dịch chiết được tinh sạch và cô đặc bằng cột chiết pha rắn (SPE) C8 hoặc C18, sau đó được phân tích bằng sắc kí rây phân tử và sắc kí pha đảo. Vitamin B 12 được xác định bằng sắc kí lỏng với detector khả kiến ở bước sóng 550 nm.
3. Thuốc thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước có điện trở suất không nhỏ hơn 15 M W cm, trừ khi có quy định khác.
3.2 Canxi sulfat , khan, cỡ hạt 8 mesh, sử dụng làm chất hút ẩm, ví dụ Drierite 1).
Pha loãng 50 ml etanol bằng nước đến 200ml.
Hòa tan 16,4 g natri axetat khan hoặc 27,2 g natri axetat ngậm ba phân tử nước trong khoảng 1800 ml nước. Chỉnh pH đến 4,50 bằng axit axetic đậm đặc. Pha loãng bằng nước đến 2 000 ml.
Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong vòng 3 tháng.
Hòa tan 0,02 g kali xyanua (độ tinh khiết ³ 97 %) trong dung dịch đệm natri axetat 0,1 M (3.4) và pha loãng đến 5 ml.
Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.
Hòa tan 0,25 g kali xyanua (độ tinh khiết ³ 97 %) trong nước và pha loãng đến 25 ml.
Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.
Hòa tan 0,6g Taka-diastaza2) trong 10 ml nước. Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.
3.8 Dung môi pha động A
Pha loãng 4,0 ml trietylamin (TEA) bằng nước đến 1 000 ml và chỉnh pH đến giá trị từ 5 đến 7 bằng axit formic đậm đặc.
3.9 Dung môi pha động B
Chuyển 4,0 ml TEA vào 250 ml axetonitril, pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và chỉnh pH đến giá trị từ 5 đến 7 bằng axit formic đậm đặc.
3.10 Dung môi pha động C
Chuyển 4,0 ml TEA vào 750 ml axetonitril, pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và chỉnh pH đến giá trị từ 5 đến 7 bằng axit formic đậm đặc.
Pha loãng 50 ml axetonitril bằng nước đến 2 000 ml.
Pha loãng 150 ml axetonitril bằng nước đến 1 500 ml.
Pha loãng 25 ml axetonitril bằng nước đến 100 ml.
Pha loãng 30 ml axetonitril bằng nước đến 100 ml.
Pha loãng 500 ml axetonitril bằng nước đến 1 000 ml. Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong 6 tháng.
3.16 Dung dịch chuẩn vitamin B12
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn tại nơi tránh được ánh sáng UV. Bảo quản các dung dịch chuẩn ở nhiệt độ từ 2 oC đến 8 o C trong bình định mức có nắp đậy kín khí.
Cân chính xác khoảng 1 mg chất chuẩn vitamin B 12 (khối lượng cân phụ thuộc vào độ chính xác của chất chuẩn). Hòa tan trong etanol 25 % (3.3) và pha loãng bằng etanol 25 % đến 100 ml. Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong 6 tháng.
Khối lượng chất chuẩn vitamin B 12 cần lấy, S w, tính bằng miligam (mg), được tính như sau:
10 000 là nồng độ cần đạt của dung dịch chuẩn gốc, tính bằng microgam trên lít ( m g/l);
0,1 là thể tích pha loãng, tính bằng lít (l);
là độ tinh khiết của chất chuẩn vitamin B 12, biểu thị theo cyanocobalamin, tính bằng microgam trên miligam ( m g/mg).
Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn gốc vitamin B 12 (3.16.1) bằng nước đến 100 ml. Dung dịch đã pha bền trong 1 tuần.
Pha loãng 0,5; 1; 2; 3; 4 và 5 ml dung dịch chuẩn trung gian vitamin B 12 (3.16.2) bằng axetonitril 10 % (3.12) đến 200 ml. Dung dịch đã pha bền trong 1 tháng.
4. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Hệ thống HPLC
Hệ gradient với khóa đổi chiều, bơm đẳng dòng và detector UV-VIS được trang bị đèn volfram, có thể hoạt động ở bước sóng 550nm và có bộ lấy mẫu tự động có thể bơm 2 ml mẫu.
4.2 Cột rây phân tử
Cột có cỡ hạt 4 m m, kích thước 250 mm x 9,4 mm 3) hoặc cỡ hạt 5 m m, kích thước 300 mm x 8 mm 4) hoặc tương đương.
4.3 Cột phân tích pha đảo
Cột phân tích C18, loại có cỡ hạt 3 m m, kích thước 100 mm x 4,6 mm 5) với cột bảo vệ có cỡ hạt 3 m m, kích thước 10 mm x 4,6 mm 6) hoặc loại tương đương.
4.5 Dụng cụ đo pH. 4.12 Pipet. 4.13 Cột SPE
Cột C8, 600 mg 7); C8, 900 mg 8); C18, 600mg 9); C18, 900mg 10) hoặc loại tương đương.
4.16 Lọ đựng mẫu. 4.17 Tủ hút 5. Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.
Mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.
6. Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị mẫu thử
Thực hiện chuẩn bị mẫu thử trong điều kiện tránh ánh sáng UV. Bảo quản mẫu thử đã chuẩn bị ở nhiệt độ từ 2 oC đến 8 o C và sử dụng trong vòng 14 ngày.
Trộn kỹ và đồng hóa mẫu thử. Cân một lượng mẫu thử thích hợp (khoảng 20 g đến 30 g mẫu thử dạng lỏng hoặc khoảng 3 g mẫu thử dạng bột), cho vào bình định mức 100 ml (4.9). Thêm 25 ml nước đối với phần mẫu thử dạng bột và trộn kỹ.
Thêm 1 ml dung dịch taka-diastaza 6 % (3.7) nếu mẫu có chứa hàm lượng tinh bột đáng kể. Để cho taka-diastaza phản ứng với mẫu trong ít nhất 30 min trước khi tiếp tục chiết mẫu theo 6.2.
6.2 Chiết mẫu
Thêm 30 ml dung dịch đệm natri axetat 0,1 M (3.4) vào mỗi phần mẫu thử và lắc bình để trộn. Đưa bình vào tủ hút (4.17), thêm 1 ml dung dịch kali xyanua 1 % (3.6) mới chuẩn bị vào mỗi bình và lắc bình để trộn.
Đun nóng mẫu ở nhiệt độ 105 oC trong tủ sấy (4.4) ít nhất 60 min và không quá 120 min (nhiệt độ tủ sấy giảm mỗi khi mở cửa tủ, thời gian đun được tiếp tục tính khi tủ sấy đạt nhiệt độ 105 o C). Sau đó, lấy mẫu ra và làm nguội ngay trong bể nước đá.
Pha loãng mẫu bằng nước đến vạch 100 ml. Trộn kỹ.
Lọc mẫu qua giấy lọc (4.10) vào bình nón dung tích 125 ml (4.8) hoặc dụng cụ thủy tinh tương đương.
CHÚ THÍCH: Nếu phần mẫu thử có chứa sữa và chứa một lượng nhỏ các hạt không hòa tan thì ly tâm mẫu và chuyển lớp chất lỏng vào phễu (4.11) qua giấy lọc (4.10).
6.3 Cô đặc mẫu
Với mỗi phần mẫu thử cần làm sạch và cô đặc, đưa cột SPE (4.13) qua vòi khóa của bộ chân không (4.15) và lắp thân xyranh dùng một lần dung tích 30 ml (4.7) vào đỉnh cột SPE. Thông thường, cột C8 hoặc C18 loại 600 mg đủ dung tích cho hầu hết các sản phẩm nhưng nếu mẫu thực phẩm ăn liền chứa hàm lượng protein cao (lớn hơn 5 %) hoặc hàm lượng protein thủy phân cao (lớn hơn 4 %) thì cần dùng cột C8 hoặc C18 loại 900 mg.
CHÚ THÍCH: Các cột C8 và C18 có thể sử dụng hoán đổi nhau.
Ổn định cột bằng ít nhất 20 ml axetonitril (3.1) và tráng mỗi cột bằng ít nhất 10 ml nước.
Dùng pipet (4.12) chuyển dịch lọc lên cột theo quy định trong Bảng 1. Có thể sử dụng chân không để dung dịch mẫu dàn đều trên toàn bộ cột. Loại bỏ dịch rửa giải.
Bảng 1 – Thể tích dịch lọc được tải lên cột SPE theo nồng độ vitamin B12 dự kiến a)
Sau khi toàn bộ dịch lọc chảy qua cột SPE, tráng cột bằng 5 ml nước và loại bỏ dịch rửa giải. Làm khô cột bằng cách hút chân không đến khi không còn dịch rửa giải chảy ra rồi khóa van.
Đặt bình định mức 5 ml hoặc 10 ml (4.9) phía dưới cột. Thêm 4,4 ml axetonitril 25 % (3.13) vào các cột SPE 600 mg và 4,4 ml axetonitril 30 % (3.14) vào các cột SPE 900 mg. Mở van khóa và cho nước rửa giải vitamin B 12 vào các bình định mức.
Sự pha loãng cuối cùng là:
Đối với dịch lọc mẫu đựng trong bình định mức 10 ml, pha loãng bằng nước đến vạch.
Đối với dịch lọc mẫu đựng trong bình định mức 5 ml, đưa vào tủ hút (4.17) và thêm 0,1 ml dung dịch kali xyanua 0,4 % (3.5) mới chuẩn bị.
Đặt các bình định mức vào tủ sấy (4.4) ở 95 o C trong ít nhất 1,5 h và không quá 4h, sau đó lấy bình ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Pha loãng bằng nước đến vạch. Lọc các lượng chứa trong bình định mức qua màng lọc 0,45 m m (4.14) vào lọ đựng mẫu (4.16).
6.4 Phân tích bằng HPLC 6.4.1 Cài đặt hệ thống
Cài đặt cấu hình của hệ thống theo Hình 1 và Hình 2.
6.4.2 Điều kiện vận hành thiết bị
a) Thời gian chạy: 30 min;
b) Thể tích bơm: 2,0 ml;
c) Cấu hình của hệ thống: theo quy định trong Bảng 2.
Bảng 2 – Cấu hình của hệ thống
d) Bơm đẳng dòng
– pha động D: Dung dịch axetonitril 2,5 % (3.11);
– tốc độ dòng: điển hình từ 1,1 ml/min đến 1,2 ml/min; điều chỉnh sao cho dịch rửa giải vitamin B 12 chảy từ cột rây phân tử trong thời gian từ 10,5 min đến 14,5 min.
CHÚ THÍCH: Để xác định tốc độ dòng thích hợp, nối trực tiếp cột rây phân tử với detector UV-Vis và bơm dung dịch chuẩn đi qua. Chỉnh tốc độ dòng sao cho dịch rửa giải vitamin B 12 chảy từ cột rây phân tử trong thời gian từ 10,5 min đến 14,5 min.
e) Bơm gradient
Thành phần dung môi pha động:
– dung môi pha động A (3.8);
– dung môi pha động B (3.9);
– dung môi pha động C (3.10).
Gradient để rửa giải vitamin B 12 trong 20 min đến 25 min: xem Bảng 3.
Bảng 3 – Gradient của cột C18
Tốc độ dòng: 1,0 ml/min.
f) Cài đặt detector
– bước sóng phát hiện: 550nm;
– băng thông: 10 nm.
6.4.3 Vận hành HPLC
Bơm dung dịch chuẩn làm việc (3.16.3) từ 3 lần đến 4 lần, độ chính xác của mỗi lần bơm £ 3 %.
Nếu hệ thống hoạt động tốt, bơm lần lượt một dãy từ 3 đến 6 dung dịch chuẩn làm việc (3.16.3), một mẫu kiểm soát, một dãy từ 1 đến 14 dung dịch mẫu thử và một dãy từ 3 đến 6 dung dịch chuẩn làm việc khác. Mỗi dãy dung dịch mẫu thử cần được sắp xếp tương ứng với các dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp.
6.5 Dựng đường chuẩn
Với mỗi nồng độ chất chuẩn, tính giá trị trung bình của diện tích pic của chất chuẩn được bơm đầu tiên và diện tích pic của chất chuẩn được bơm cuối cùng trong dãy mẫu. Dựng đường chuẩn tuyến tính bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất của nồng độ chất chuẩn theo diện tích pic trung bình của các dung dịch chuẩn làm việc.
Đường chuẩn phải có hệ số tương quan ít nhất là 0,999.
Với mỗi nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc, diện tích pic của chất chuẩn được bơm đầu tiên và diện tích pic của chất chuẩn được bơm cuối cùng không được dao động quá 10 %.
7. Tính kết quả
Kiểm tra sắc kí đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử và kiểm tra độ phân giải của vitamin B 12 của các pic trên sắc kí đồ (xem Phụ lục A).
Tính diện tích pic vitamin B 12. Cần đảm bảo rằng diện tích pic của dung dịch mẫu thử nằm trong dải diện tích pic của các dung dịch chuẩn làm việc.
Tính phần khối lượng của vitamin B 12 trong mẫu thử, X, bằng microgram trên kilogam ( m g/kg), theo công thức sau:
X =
là nồng độ vitamin B 12 trong dung dịch mẫu thử được bơm vào thiết bị HPLC (xem 6.4.3), được xác định từ đường chuẩn, tính bằng microgram trên lít ( m g/l);
là thể tích dung dịch pha loãng thứ nhất, tính bằng mililit (D 1 = 100 ml);
là thể tích dung dịch pha loãng cuối cùng, tính bằng mililit (ml);
là thể tích dịch lọc được đưa lên cột SPE, tính bằng mililit (ml);
8. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:
a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
Phụ lục A Dữ liệu về kết quả đánh giá xác nhận phương pháp
Dữ liệu về kết quả đánh giá xác nhận phương pháp trên các nền mẫu thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh và sản phẩm dinh dưỡng được nêu trong Bảng A.1
Bảng A.1 – Dữ liệu về kết quả đánh giá xác nhận phương pháp Phụ lục B Sắc kí đồ điển hình
Hình B.1 – Ví dụ 1
Hình B.2 – Ví dụ 2 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Karen Schimpf, Renee Spiegel, and Linda Thompson: Determination of Vitamin B in Infant Formula and Adult Nutritionals by HPLC, J. AOAC International Vol. 95, No. 2, 2012
Cập nhật thông tin chi tiết về Tiêu Chuẩn Quốc Gia Tcvn 7902:2008 (Iso 15213 : 2003) Về Vi Sinh Vật Trong Thực Phẩm Và Thức Ăn Chăn Nuôi trên website Channuoithuy.edu.vn. Hy vọng nội dung bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu của bạn, chúng tôi sẽ thường xuyên cập nhật mới nội dung để bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!