Bạn đang xem bài viết Phân Biệt Các Kĩ Thuật Xét Nghiệm Pcr: Rt được cập nhật mới nhất trên website Channuoithuy.edu.vn. Hy vọng những thông tin mà chúng tôi đã chia sẻ là hữu ích với bạn. Nếu nội dung hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất.
PCR (hay là phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase) là một kĩ thuật hiện đại, được ứng dụng rộng rãi trong Y khoa, như trong chuẩn đoán bệnh di truyền, bệnh do vi khuẩn, virus, ADN “dấu vân tay”, xác định huyết thống…
Nguyên lý hoạt động của PCR là tạo ra một lượng lớn các bản sao ADN từ một đoạn ADN chọn lọc, ở môi trường in vitro tương tự như trong quá trình phân bào, trong một thời gian ngắn. Lượng lớn ADN tạo thành được so sánh, đối chiếu với các mẫu chuẩn tại các ngân hàng dữ liệu ADN, các thông số, các đặc điểm chuẩn đã có sẵn để đưa ra kết quả.
Vậy, trong trường hợp vật chất di truyền không phải là ADN thì sao? Với những virus có vật chất di truyền là ARN, liệu có sử dụng được PRC không?
Để hiểu rõ vấn đề này chúng ta cần phân biệt được 2 kiểu phản ứng PCR:
Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực
(
Real-time PCR
)
, còn gọi là qPCR.
Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (
Reverse transcription PCR
), gọi tắt là RT-PCR
1.
Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR)
qPCR là quá trình khuếch đại (sao chép) một đoạn ADN xác định lên hàng trăm nghìn lần, đủ để phân tích. Trước đó, các mẫu xét nghiệm được xử lý bằng hóa chất để tách chiết ADN từ mẫu đó.
qPCR, ngoài là “PCR định lượng”, còn có nhiều các ứng dụng khác, tiêu biểu như:
Phát hiện gene mục tiêu (Định tính). Kết quả có thể là Âm/Dương
Xác định kiểu gene (genotype, týp) của gene mục tiêu. Kết quả trả ra là genotype A, B, C, v.v…,
Một số phản ứng khuếch đại ADN có bản chất là PCR, chúng đẳng nhiệt, nghĩa là chúng chạy ở một nhiệt độ không đổi. Và tiêu biểu nhất là khuếch đại phụ thuộc vào enzyme Helicase – một loại enzyme tháo xoắn – tương tự như PCR truyền thống, nhưng sử dụng nhiệt độ không đổi thay vì qua các bước tách chuỗi đôi ADN và phối hợp/mở rộng chuỗi bởi biến đổi nhiệt.
Hai phương pháp phổ biến để phát hiện các sản phẩm trong qPCR là sử dụng:
Thuốc nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu xen kẽ với bất kỳ ADN sợi kép.
Đầu dò đặc hiệu gồm oligonucleotide được dán nhãn bằng máy phóng
huỳnh quang
.
2. Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR)
RT-PCR hiểu đơn giản là: đầu tiên cần sử dụng quá trình phiên mã ngược (tức chuyển ARN thành ADN lấy từ mẫu virus hay vi khuẩn có vật chất di truyền là ARN) để thu được ADN, sau đó dùng qPCR để khuếch đại ADN đó, đủ để phân tích. Quy trình RT-PCR thường cần khoảng 3h hoặc hơn.
Hình 1. RT-PCR và qPCR
RT-PCR có thể được tiến hành theo phương thức một bước và hai bước.
* RT-qPCR một bước, giai đoạn tổng hợp ADN (phiên mã ngược) và qPCR được tiến hành trong cùng một ống phản ứng bằng cùng một enzym. Phương thức này chỉ có thể sử dụng mồi đặc hiệu.
* RT-qPCR hai bước, giai đoạn tổng hợp ADN và qPCR được tiến hành trong hai ống phản ứng riêng biệt với enzym, đệm, thành phần và điều kiện phản ứng được tối ưu cho mỗi giai đoạn.
Hình 2. Sao chép ngược (RT-PCR) và tổng hợp ADN (qPCR)
Khuôn của RT-PCR là ARN, ARN này có thể nằm trong hỗn hợp ARN tổng số hoặc chỉ riêng mARN. Tách chiết ARN tổng số cần ít bước thực hiện hơn, giúp cho hiệu suất tách chiết cao hơn đồng thời thuận lợi hơn khi định mức lượng tế bào đầu vào. Ngoài ra, do không có bước làm giàu riêng mARN, sử dụng ARN tổng số không gây khác biệt trong hiệu suất tách chiết các loại mARN khác nhau. Những ưu thế trên đã giúp cho ARN tổng số được ưu tiên chọn làm vật liệu khởi đầu phù hợp cho RT-PCR hơn là mARN tinh sạch chỉ giúp phản ứng có độ nhạy cao hơn một chút.
Hình 3. Một số loại mồi dùng trong RT-PCR.
Mồi (Primer) phổ biến hay dùng trong RT-PCR là oligo dT và mồi ngẫu nhiên, nó sẽ liên kết bổ sung với khuôn ARN và làm điểm bắt đầu cho phản ứng tổng hợp ADN.
Enzym phiên mã ngược tiến hành phản ứng tổng hợp ADNc từ khuôn ARN. Một số enzym có hoạt tính RNAse cho phép phân hủy khuôn ARN sau khi đã tổng hợp ADN. Nếu enzym không có hoạt tính này, có thể cần bổ sung RNAse nhằm tăng hiệu quả của qPCR. Loại enzym phiên mã ngược thường dùng là enzym phiên mã ngược của virus ung thư bạch cầu chuột moloney (M-MLV) và virus cúm gia cầm (AMV). Tiêu chuẩn của một enzym phiên mã ngược lý tưởng cho phản ứng RT-PCR là có độ bền nhiệt tốt, cho phép tổng hợp hiệu quả ADN ở nhiệt độ cao trên những khuôn ARN có nhiều vùng cấu trúc bậc hai.
Cặp mồi lý tưởng cho phản ứng qPCR trong RT-PCR thường được thiết kế nằm trùm qua vị trí nối giữa hai exon. Một trong hai mồi sẽ nằm vắt ngang vị trí nối giữa 2 exon này, khiến cho mồi chỉ bắt cặp đặc hiệu với ADN mà không thể liên kết với ADN tổng số do ở ADN tổng số chứa intron nằm xen giữa các exon. Thiết kế này giúp loại bỏ nguy cơ khuếch đại nhầm ADN tổng số.
Nếu không thể thiết kế mồi chùm qua vị trí nối giữa exon hoặc nằm trên 2 exon được ngăn cách bới intron dài, cần phải xử lý mẫu ARN với enzyme RNAse-free ADNase I hoặc ds-ADNase để loại bỏ ADN tổng số.
Hình 4. Thiết kế đoạn mồi trong RT-PCR
Khác với các phương pháp PCR thông thường hay qPCR chỉ khuếch đại được ADN thì RT-PCR cho phép chúng ta xác định được cả những loại virus, vi khuẩn mang vật chất di truyền là ARN cũng như xác định được trình tự của một đoạn ARN bất kì nào đó một cách dễ dàng hơn.
Đây cũng là một trong những phương pháp được áp dụng nhiều nhất song song với test kháng thể (antibodies) để phục vụ cho truy vết và xét nghiệm một sô loại virus như Zika, HIV, sởi,… nói chung cũng như SARS-CoV-2 đang hoành hành gần đây nói riêng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. ThS. BS. Vũ Thị Thúy Chi, Xét nghiệm PCR có những ưu – nhược điểm gì? Trung tâm Xét nghiệm, Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC, 2023
2. Công ty TNHH Hamesco Việt Nam, Kĩ thuật Real-time PCR là gì? 2023.
3. RT-qPCR – Các nguyên lý cơ bản, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học, Dịch và tổng hợp từ Thermo Scientific BioMedia VN.
4. Nguyễn Thành Khôi, 4 Sự thật gây mất lòng về real-time PCR! Sinh học phân tử.
5. Xét Nghiệm SARS-CoV-2 / COVID-19, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương.
6. Kỹ thuật Realtime PCR – đếm tải lượng virus, vi khuẩn, BioMedia, 2023.
7. chúng tôi Trần Bá Thoại, Uỷ viên BCH Hội Nội tiết Việt Nam, Xét nghiệm PCR trong chẩn đoán Y khoa, Đại học Phan Châu Trinh
Người viết bài:
SV. Vũ Hoài Hương Giang
SV. Hoàng Quốc Cường
Hiệu đính: chúng tôi Ngô Thiện
=====
Để nhận tư vấn về sản phẩm và đặt hàng, vui lòng liên hệ:
CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC PHẨM FYKOFA
Hotline: 1800 234 555 (Miễn phí) Email: info@fykofa.com Website: www.fykofa.com Fanpage: www.fb.com/duocphamFYKOFA
Những Ai Cần Làm Xét Nghiệm Rt
Trong những ngày này bạn có thể nhiều lần nghe tới cụm từ ” xét nghiệm khẳng định” trong các bản tin COVID-19. Đó chính là xét nghiệm sinh học phân tử realtime RT-PCR.
Giá trị của xét nghiệm realtime RT -PCR
– Xét nghiệm sinh học phân tử realtime RT-PCR là một phương pháp xét nghiệm xác định sự hiện diện của virut thông qua phát hiện vật liệu di truyền của virut SARS-CoV-2, đây là phương pháp có độ chính xác cao. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi các hệ thống máy chuyên dụng và thực hiện tại phòng thí nghiệm.
-Xét nghiệm realtime RT-PCR có thể cho ra kết quả định lượng nồng độ virut tại thời điểm xét nghiệm. Kết quả có thể giúp bác sĩ tiên lượng tiến triển bệnh, cũng như đánh giá được hiệu quả điều trị.
– Ngừơi nghi nhiễm SARS-CoV-2 (có dấu hiệu, triệu chứng)
– Người tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân COVID-19 ( F1)
– Những người nhập cảnh từ các nước có dịch ( cách ly tập trung)
– Bệnh nhân COVID-19 trong quá trình điều trị
– Theo chỉ định của bác sĩ/ cán bộ điều tra/ cơ quan y tế
Xét nghiệm sinh học phân tử realtime RT-PCR đòi hỏi các hệ thống máy chuyên dụng và thực hiện tại phòng thí nghiệm.
Mẫu bệnh phẩm
Dịch đường hô hấp trên ( mũi, họng)
Dịch đường hô hấp dứơi ( phế quản, nội khí quản)
Thời điểm xét nghiệm
Theo chỉ định của bác sỹ/ điều tra viên.
Xét nghiệm realtime RT-PCR có thể phát hiện các trường hợp nhiễm virut SARS-CoV-2 tại giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh ( 1-2 ngày trước khi có triệu chứng đầu tiên) và giai đoạn toàn phát bệnh.
Nếu xét nghiệm realtime RT-PCR dương tính, đối tượng xét nghiệm được xác định đang nhiễm virut và có khả năng phát tán virut và lây truyền cho người khác.
Nếu bạn ở trường hợp này, cần phải đến ngay cơ sở điều trị được chỉ định, hợp tác và tuân thủ các y lệnh của bác sĩ. Bạn cũng cần khai báo đầy đủ các thông tin về lịch trình di chuyển, lịch sử tiếp xúc với ngừơi khác trong vòng 14 ngày trước khi xét nghiệm dương tính với cán bộ điều tra để thực hiện các biện pháp phòng dịch theo đúng quy định.
– Kết quả âm tính
Nếu xét nghiệm realtime RT-PCR âm tính, đối tượng xét nghiệm được xác định không nhiễm virut SARS-CoV-2 tại thời điểm lấy mẫu xét nghiệm.
Nếu bạn ở trường hợp này, bạn chưa nhiễm virut SARS-CoV và có khả năng sẽ nhiễm vì vậy bạn cần tuân thủ các quy định phòng chống dịch COVID-19. Nếu có các triệu chứng nghi ngờ ( mệt, sốt, ho , khó thở), bạn nên liên hệ với các cơ sở y tế gần nhất khai báo để được tư vấn và chỉ định làm các xét nghiệm lại.
PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai- Phó Giám đốc Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương
Nguồn: https://suckhoedoisong.vn/nhung-ai-can-lam-xet-nghiem-sinh-hoc-phan-tu-n178698.html
Xét Nghiệm Pcr Trong Chẩn Đoán Y Khoa
Đến nay, với các bệnh nhiễm trùng, ngành y vẫn áp dụng định đề Koch là phải chỉ ra vi sinh vật gây bệnh. PCR là xét nghiêm “định danh” ở mức gene phân tử có giá trị rất lớn giúp chẩn đoán khá nhiều căn bệnh khó trước đây.
PCR là gì? Lịch sử phát minh ra nó?
PCR (Chuỗi Phản ứng Polymerase, Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật phát hiện AND (hoặc ARN) của mầm bệnh hiện diện trong bệnh phẩm nhở vào phản ứng chuỗi enzyme polymerase khuếch đại lên cả triệu lần trong một thời gian ngắn. Nhờ PCR, từ một mẫu rất nhỏ AND (ARN), như từ một giọt máu, một sợi tóc hay chỉ một tế bào… phòng xét nghiệm có thể nhân lên, phóng đại ra hàng triệu bản cho các quá trình khảo sát, xác định tiếp theo.
PCR vận hành ra sao?
Nguyên lý hoạt động của PCR là dùng enzyme trùng hợp polymerase để nhanh chóng tạo ra một lượng lớn các bản sao từ một đoạn AND (ARN) chọn lọc.
Quy trình thực hiện PCR qua ba bước chính: biến tính; kết hợp; và mở rộng (extension), lặp lại từ 30-40 chu kỳ. Chu trình được thực hiện trên một máy quay tự động, một thiết bị làm nóng nhanh và làm lạnh các ống nghiệm chứa hỗn hợp phản ứng.
* Biến tính (denaturation) thực hiện ở 94o C, giúp sợi xoắn kép DNA tách thành hai đoạn DNA chuỗi đơn.
* Ủ kết hợp (annealing) thực hiện ở 54o C, các cặp mồi kết hợp với “mẫu” chuỗi đơn, enzyme polymerase gắn vào và bắt đầu sao chép mẫu.
* Mở rộng (extension) thực hiện ở 72o C, polymerase tổng hợp các chuỗi DNA bổ sung cho mẫu được ghép với mồi, tạo ra một phân tử DNA sợi kép.
Các chu kỳ được đi lặp lại nhiều lần, nhiều bản sao được tạo ra và số lượng bản sao của mẫu được tăng theo cấp số nhân.
Đặc biệt, với các virus RNA, như HIV, sởi, quai bị, ZIKA… phòng xét nghiệm sẽ dùng enzyme sao chép ngược reverse trancriptase (RT) để biến đổi đoạn RNA của virus thành DNA rồi tiến hành PCR, xét nghiệm này gọi là RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật này có hai giai đoạn:
* Tổng hợp DNA bổ sung từ RNA bằng vào enzyme sao chép ngược (RT),
* Khuếch đại DNA bổ sung này bằng PCR chính thống.
Những ứng dụng của PCR
Kỹ thuật PCR cho phép con người nhân lên cả triệu đoạn AND (ARN) trong thời gian rất ngắn. Vì thế, hiện nay PCR đã trở thành công cụ thiết yếu cho các nhà sinh học, phòng thí nghiệm pháp y, di truyền… ứng dụng để chẩn đoán bệnh di truyền, xác định vi khuẩn và virus, lấy dấu DNA vân tay, nghiên cứu sự tiến hóa của con người, nhân bản DNA của xác ướp, xác định quan hệ huyết thống hay sinh học.v.v…
* Phát hiện các mầm bệnh không thể nuôi cấy thường quy được như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
* Phát hiện các vi khuẩn bệnh lây tình dục (sex transmitted diseases STDs (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
* Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì ít có mặt trong bệnh phẩm, rất chậm phát triển, hay đã bị điều trị kháng sinh trước đó (lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).
* Phát hiện nhanh các chủng virus Dengue của bệnh sốt xuất huyết.
* Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gene APC trong ung thư đại tràng, gene BRCA1, BRCA2 trong ung thư vú, gene TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin…)
* Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…
* Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL betalactamase, hay carbapenemase…)
* Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli.
* Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gene, dòng hoá gene, giải mã trình tự ADN…
Ưu, nhược điểm của PCR
Xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm thông thường khác như: (1) Cho kết quả xét nghiệm nhanh, không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét nghiệm; (2) Độ đặc hiệu rất cao; (3) Phát hiện được nhiều tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm hóa, sinh hay miễn dịch truyền thống không phát hiện được (4) Cho kết quả định lượng số copies virus, hỗ trợ bác sĩ điều trị đánh giá giai đoạn, hiệu quả điều trị, và tiên lượng bệnh; (5) Phát hiện các đột biến gene gây ung thư, và các bệnh di truyền khác…nhằm có biện pháp phòng ngừa bệnh.
Các nhược điểm của xét nghiệm PCR hiện tại: (1) Phải có labo hiện đại, chuẩn mực. Ngoài labo hiện đại, PCR cũng đòi hỏi kỹ thuật viên, bác sĩ phải có trình độ chuyên môn cao, (2) Giá thành xét nghiệm PCR còn khá cao; và (3) Vài trường hợp như đã dùng kháng sinh, lấy hay bảo quản bệnh phẩm sai quy cách có thể ức chế PCR khiến độ nhạy của xét nghiệm thấp.
Đôi điều bàn luận
Trong y khoa, chẩn đoán xác định nguyên nhân gốc rễ (root cause) của căn bệnh là khâu đầu tiên và quan trọng nhất. Đặc biệt, trong các bệnh nhiễm trùng, cho đến nay ngành y vẫn áp dụng định đề Koch (Koch’s postulates) đưa ra từ năm 1884 “Tiêu chuẩn vàng để chẩn bệnh nhiễm là chỉ ra vi sinh vật gây bệnh”. Trong thực tế lâm sàng, rất khó đạt được nguyên tắc Koch này vì: (1) lượng vi sinh vật quá ít khó hoặc không phân lập đươc, (2) vi sinh vật nhân lên quá chậm, không kịp cho khâu điều trị đặc hiệu; (3) nhiều yếu tố tác động lên việc thu thập bệnh phẩm.
Theo lý thuyết, PCR là xét nghiệm “định danh” (identify) ở mức phân tử, bộ gene di truyền hiện đại, nên có độ đặc hiệu (specificity) rất cao, gần tuyệt đối đáp ứng “định đề Koch” để xác định bệnh. Với enzyme polymerase, một mẫu ADN (ARN) rất nhỏ, labo xét nghiệm dễ dàng nhân lên cả ngàn, triệu lần trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 5 giờ), khiến việc nhận diện mầm bệnh quá dễ dàng, thuận lợi và điều trị kịp thời hơn. Do đó, hiện nay PCR được ứng dụng khá rộng rãi trong y khoa để xác định chẩn đoán.
Tuy có quá nhiều ưu điểm, nhưng cũng như các xét nghiệm chẩn đoán khác, PCR vẫn có nhược điểm “chết người” là độ nhạy (sensitivity, Se) trong một số bệnh phẩm còn thấp, nghĩa là cho “âm tính giả” còn cao. Điển hình là PCR trong bệnh viêm màng não lao (tuberculous meningitis), một bệnh đòi hỏi phải chẩn đoán và điều trị sớm để tiên lượng tốt và ít biến, di chứng. Dù PCR lao cho dịch não tủy có độ đặc hiệu Sp cao gần tuyệt đối 98%, nhưng độ nhạy Se lại rất thấp 56%. Vì thế, các bác sĩ lâm sàng thường phải: (1) Làm PCR lao thêm trên các mẫu khác, như máu, nước tiểu, đờm, dịch màng phổi, màng bụng; và (2) Làm thêm các xét nghiệm khác như IDR, soi đàm, chụp phổi…
TS.BS Trần Bá Thoại,Uỷ viên BCH Hội Nội tiết Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] PCR (Polymerase Chain Reaction) https://www.medicinenet.com/pcr_polymerase_chain_reaction/article.htm [2] PCR in diagnosis of infection: Detection of bacteria in cerebrospinal fluidshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC119969/ [3] How does the PCR work ?https://www.youtube.com/watch?v=3XPAp6dgl14 [4] Polymerase Chain Reaction (PCR)https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo [5] Basic Principles of RT-qPCRhttps://www.thermofisher.com/vn/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/spotlight-articles/basic-principles-rt-qpcr.html [6] Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/biological-sciences-practice/biological-sciences-practice-tut/e/reverse-transcriptase-polymerase-chain-reaction--rt-pcr--of-a-uv-dependent-gene [7] RT PCR (Reverse transcription PCR)https://www.slideshare.net/iqrawazir7/rt-pcr-reverse-transcription-pcr [8] Diagnostic accuracy of nucleic acid amplification tests for tuberculous meningitis: a systematic review and meta-analysishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14522262 [9] Nucleic acid amplification tests in the diagnosis of tuberculous pleuritis: a systematic review and meta-analysishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC387423/ [10] Diagnosed tuberculous meningitis using cerebrospinal fluid polymerase chain reaction in patients hospitalized with the diagnosis of meningitis in referral hospitals in Isfahanhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4468224/Tìm Hiểu Về Dịch Vụ Xét Nghiệm Xác Định Đột Biến Gen Bằng Kỹ Thuật Pcr
Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Vì vậy, trong trường hợp bệnh do nhiều đột biến và cần xác định các đột biến này thì nên sử dụng kỹ Multiplex PCR. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR cho phép phát hiện được đồng thời nhiều đột biến.
I. NGUYÊN LÝ Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Vì vậy, trong trường hợp bệnh do nhiều đột biến và cần xác định các đột biến này thì nên sử dụng kỹ Multiplex PCR. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR cho phép phát hiện được đồng thời nhiều đột biến.
II. CHỈ ĐỊNHXét nghiệm này được chỉ định cho tất cả các người bệnh mắc bệnh máu do các đột biến gen.
III.CHỐNG CHỈ ĐỊNH IV. CHUẨN BỊ1. Người thực hiện Kỹ thuật viên xét nghiệm Sinh học phân tử đã được đào tạo. 2. Phương tiện – Hóa chất 2.1. Phương tiện – Máy PCR; – Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh; – Buồng vô trùng (biology cabinet); – Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút); – Máy vortex; – Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl; – Đầu côn có màng lọc; – Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza; – Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza; – Tủ lạnh 4-8 o C, tủ âm sâu -20 o C;
195 – Găng tay. 2.2. Hóa chất – Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối). – Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl 2 , dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng. – Các cặp mồi đặc hiệu cho các đột biến cần xác định và 1 cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control). – Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN. – Thuốc nhuộm ethidium bromide. 3. Bệnh phẩm 2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA. 4. Phiếu xét nghiệm Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH1. Lấy bệnh phẩm 2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. 2. Tiến hành kỹ thuật Bước 1. Tách chiết ADN Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi” Bước 2. Thực hiện phản ứng Multiplex PCR – Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn. – Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 ml: Buffer, dNTPs, MgCl2 (nếu trong Buffer chưa có), hỗn hợp mồi (gồm các cặp mồi phát hiện đột biến được trộn theo tỷ lệ nhất định), enzym Taq polymerase, nước khử ion vô trùng, ADN khuôn. – Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn. – Đặt vào máy PCR. – Chọn chương trình. – Bấm start để máy chạy. Bước 3: Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:
196 – Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt. – Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X…) vào bình, lắc đều. – Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn. – Để ấm đến 60 0 rồi đổ vào khay đã cắm lược. – Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra. Điện di: – Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu + 4 µl dH 2 0 – Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự – Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp – Đặt bản gel vào máy điện di – Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút – Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết. VII . NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ SAI SÓT XỬ TR
Cập nhật thông tin chi tiết về Phân Biệt Các Kĩ Thuật Xét Nghiệm Pcr: Rt trên website Channuoithuy.edu.vn. Hy vọng nội dung bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu của bạn, chúng tôi sẽ thường xuyên cập nhật mới nội dung để bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!